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尿中Cell-free DNA(cfDNA)濃度測定

尿中Cell-free DNA(cfDNA)濃度測定

■尿中Cell-free DNA濃度測定
　血漿・血清などの体液検体にはCell-free DNA(以下cfDNA)が含まれています。cfDNAはがんなどの疾患の状態を反映しているとされ有用な情報を得られることから、腫瘍分野のバイオマーカー研究に用いられている低侵襲的なリキッドバイオプシーの一つです。しかしながら、血液サンプルからのcfDNAの単離は、血中に含まれるcfDNA量が少ないために通常の採血量では十分な量のcfDNA量を得ることができないため、大量の血液サンプルが必要になります。

　cfDNAは血液だけではなく、さまざまな体液から単離することができます。その一つである尿には、血液循環に入り込んで腎臓関門を通過したDNAが含まれています。尿は、採血と比較して真に非侵襲的かつ簡便な方法で大量に採取できるため、リキッドバイオプシーのためのCell-free DNA(cfDNA)の重要な供給源として研究されています。また、大腸癌症例において腫瘍で同定された変異が、血漿由来のCell-free DNA(cfDNA)では検出されず、尿由来のcfDNAで検出されたという報告もあります。(参考文献1,2を参照)

参考文献
1.Urinary cell-free DNA analysis for tumor mutation detection in patients with oligometastatic colorectal cancer.

Bruna Pellini, et al. 2020 ASCO Virtual Scientific Program. Abstract #:e15545 (J Clin Oncol 38:2020 abstract e15545)

2.大腸癌症例における尿中のcell-free DNAの抽出およびRAS変異解析の試み
Kusakabe, et al. The 119th Annual Congress of Japan Surgical Society (2019), SF-049.

　尿中のcfDNAには遺伝情報に関する様々な潜在的可能性がありますが、抽出には標準化されたプロトコールがありません。また採尿後の処理・保管中に有核細胞またはゲノム核酸などによってバックグラウンドが増加する傾向がありました。
　弊社では、採尿時に安定化剤を加えることにより、尿中のcfDNAを安定化させ、抽出プロトコールを最適化し、キャリアタンパクを用いてcfDNAを濃縮し、高収率に回収することが可能になりました。
抽出試薬はQuick-DNA Urine Kit　Zymo Research社を使用しました。

　下記に、健常者および膀胱がん患者の尿中から濃縮・回収・抽出したcfDNA濃度とサイズの測定例をご紹介します。
測定機器:Agilent 2200 Tape Station System(アジレント・テクノロジー株式会社)

東北医科薬科大学　医学部　泌尿器科学講座　佐藤信教授グループとの共同研究
健常者尿　　cfDNA濃度とサイズ測定例

膀胱がん患者尿　　cfDNA濃度とサイズ測定例

東北医科薬科大学　医学部　泌尿器科学講座　佐藤信教授グループとの共同研究

膀胱がん患者の尿からcfDNAを抽出し5遺伝子のメチル化測定を行いました。

尿は-80℃で保存したものを用いました。融解後、所定の方法によりcfDNAを抽出しました。得られたcfＤＮＡ抽出物をバイサルファイト処理後、メチル化特異的定量PCR法(qMSP法)によりリアルタイムPCRを使用し実施しました。プライマープローブの設計は、弊社が開発したHypercoolテクノロジー™に基づいて行いました。バイサルファイト処理ごとに内在性コントロールとしてβ‐アクチン(ACTB)を用いて精度管理を実施しました。5遺伝子のメチル化コピー数をメチル化スコアとして数値化し評価しました。計算式はFisher法に従っております。

計算式　＝-2Σlog(1-φ（（m-μ）/σ））

膀胱がん患者尿中cfDNAのメチル化測定

AUC　0.9250

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■提出条件

※本測定のご依頼に際しては弊社との共同研究契約が必要となります。専用保存容器につきましては共同研究契約締結後、弊社より必要数をお送りします。

◇尿サンプルは初尿を採取してください。
　尿の採取量につきましては、専用保存容器に14mlほど入れてお送りください。

尿サンプルの保管方法:尿採取前の専用保存容器は室温保存。
尿サンプルは採尿後、室温では24時間、凍結保存(-20℃)であれば1か月以上安定して保存可能です。

尿サンプル発送先
株式会社日本遺伝子研究所 CTCラボ
〒983-0013 宮城県仙台市宮城野区中野1-5-28
TEL:022-388-9741

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■受付日・時間帯

本測定は事前予約制です。
予約は株式会社日本遺伝子研究所 CTCラボまでご連絡ください。(TEL:022-388-9741)
検体発送は弊社に祝祭日を除く平日の火曜日～金曜日、午前中必着。

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■お問い合わせ
株式会社日本遺伝子研究所　CTCラボ
TEL:022‐388‐9741　FAX:022-388-9740
E-mail:ctc-lab@ngrl.co.jp