研究支援サービス

血漿からのexosome DNA(exoDNA)のメチル化測定

血漿からのexosome DNA(exoDNA)のメチル化測定

1)Exosome(エクソソーム)とは?
エクソソームはエンドソームが起源の細胞外小胞の一つのクラスで、すべての細胞から分泌される直径40-150nmの顆粒状の脂質二重膜からなる物質です。エクソソームは、タンパク質、脂質、核酸などの特定の組成を含み、シグナルをレシピエント細胞に伝達することができるため、細胞間コミュニケーションに関与していることが知られています。

エクソソームに含まれる核酸の一つであるmicroRNA(miRNA)は、リキッドバイオプシーにおけるがん研究においてよく知られていますが、2014年にエクソソーム中に二本鎖DNAが含まれることが明らかになり、がんの診断とモニタリングにおける有用性が見出されて、注目されています。

<エクソソーム中のDNAについての参考例>
・Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2016. 81: 275-280
・Christoph Kahlert, Cancer Res; 79(10) May 15, 2019, 2462-2465

　弊社では、この世界中で研究中のエクソソーム中のDNA(exoDNA)に着目し、その抽出と測定についての研究開発を進めてまいりました。exoDNAは抽出方法によってバラつきがあり、安定した抽出が困難でありますが、弊社では再現性良く抽出する方法を確立することができました。

　弊社におけるCTC測定において、健常者※1でありながらCTCが1個以上検出されたかたは全体の約8%であり、その後の経過で、そのうち3名に早期がんが検出されたことから、「健常者※1でありながらCTCが1個以上検出された方々」を未病(ハイリスクグループ)と区分して、Cell Free DNAと同様にexoDNAにおいてもメチル化測定を実施しました。

※1：ここでの健常者サンプルは健診希望者で喫煙者やがん以外の疾患をもつ方も含む臨床サンプルです。

2)exoDNAの濃縮・抽出
血漿0.5mlを使用しました。
Exosome濃縮試薬はTotal Exosome Isolation Kit(from plasma)invitrogen™を使用。
exoDNA抽出試薬はQIAamp MinElute Virus Spin kit QIAGEN社を使用しました。

exoDNA抽出後の濃度と断片長(参考例)

3)メチル化測定
がんで過剰メチル化されるがん抑制遺伝子プロモーター領域の候補を論文から多数選別後、予備実験により10遺伝子まで絞り込みました。その中から5遺伝子のメチル化測定を行いました。測定は、ＤＮＡ抽出物をバイサルファイト処理後、メチル化特異的定量PCR法(qMSP法)によりリアルタイムPCRを使用し実施しました。5遺伝子のメチル化コピー数をメチル化スコアとして数値化し評価しました。計算式はFisher法に従っております。計算式＝-2Σlog(1-φ（（m-μ）/σ））

4)exoDNAメチル化測定の結果
Total exosomeから抽出したDNAを材料にしたメチル化測定ではCell Free DNAよりも健常者と未病(ハイリスクグループ)の間にAUCが0.72と有意な差が認められました。

<血漿由来exoDNAの遺伝子プロモーターCpGアイランドの高メチル化>

<各癌種Total exosomeDNA(exoDNA)のROC曲線(Receiver Operating Characteristic) curve>

メチル化関連サービス
Hypercoolテクノロジー™で設計したHypercool-qMSP PPセット
Hypercool-qMSP デザイン
⇒詳細はこちら

---

◆提出条件
※本測定のご依頼に際しては弊社との共同研究契約が必要となります。専用採血管につきましては共同研究契約締結後、弊社より必要数をお送りします。

◇Total exosomeDNA(exoDNA) Methylation Assayをご依頼の場合
弊社指定EDTK-3K 2mLの採血管を使用。
・採血前の容器→常温保存(15～30℃)
・採血後の容器→常温保存(15～30℃)
採血後すぐに、血液をゆっくりと10回転倒混和し、室温で保存してください。
検体は採血後24時間以内に弊社必着。

---

◆受付日・時間帯
本測定は事前予約制です。
検体発送は弊社に祝祭日を除く平日の火曜日～金曜日、午前中必着。

---

◆お問い合わせ
(株)日本遺伝子研究所 CTCラボ
TEL:022-388-9741 FAX:022-388-9740
E-mail: ctc-lab@ngrl.co.jp