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Methylation アッセイ(cfDNA・exoDNA)

Methylation アッセイ(cfDNA・exoDNA)

 がん細胞には、様々な突然変異とDNAメチル化異常が蓄積していることがわかってきました。DNAメチル化は、ほとんどがシトシン(C)で生じ、特に遺伝子プロモーター領域のCpGアイランド(CGという配列が集中して存在する領域)のシトシンが高度にメチル化されることで遺伝子発現が制御されます。メチル化が正常に制御されることにより、発生や分化が正常に制御されますが、がん細胞ではがん抑制遺伝子のCpGアイランドが異常にメチル化され、がん抑制遺伝子の発現が抑制されるために、がん化に関与することが知られています。

 近年では、DNAメチル化異常は、多様な前癌病変の細胞で起きていること、1つのがん細胞の中でも非常に多くの遺伝子に起こっていることなどがわかってきました。このようにがん抑制遺伝子プロモーター領域のCpGアイランドのメチル化測定は注目されてきました。

さて、弊社において2016年から2021年2月までにCTC検査を行った結果を集計すると健常者※11238名中のCTC数は、0個が1144名、1個が86名、2個が6名、3個が2名となりました。(図1を参照)
※1:ここでの健常者サンプルは喫煙者やがん以外の疾患をもつ方も含む臨床サンプルです。

図1. 健常者※2のCTC数

健常者※2でありながらCTC計測で1個以上検出された方は全体の約8%であり、うち3名に早期癌が検出されました。このことから、共同研究参加施設(20施設)より提供された癌患者(術後や加療中)、並びに「CTC数がゼロの健常者(健常者として区分)」と、「健常者※2でありながらCTC計測で1個以上検出された方」(未病として区分)を対象にCell-free DNA(以下 cfDNA)とTotal exosomeDNA(以下exoDNA)を抽出してメチル化測定を行い、早期がん検出の可能性を調べました。
※2:※1と同義で喫煙者やがん以外の疾患をもつ方を含みます。

方法
1)cfDNAの抽出
弊社HPで公開した方法で行いました。
⇒詳細はこちら

2)exoDNAの濃縮・抽出
血漿0.5mlを使用しました。
Exosome濃縮試薬はTotal Exosome Isolation Kit(from plasma) invitrogen™を使用。
exoDNA抽出試薬はQIAamp MinElute Virus Spin kit QIAGEN社を使用しました。

3)メチル化測定
がんで過剰メチル化されるがん抑制遺伝子プロモーター領域の候補を論文から多数選別後、予備実験により10遺伝子まで絞り込みました。その中から5遺伝子のメチル化測定を行いました。測定は、DNA抽出物をバイサルファイト処理後、メチル化特異的定量PCR法(qMSP法)によりリアルタイムPCRを使用し実施しました。プライマープローブの設計は、弊社が開発したHypercoolテクノロジー™に基づいて行いました。バイサルファイト処理ごとに内在性コントロールとしてβ‐アクチン(ACTB)を用いて精度管理を実施しました。5遺伝子のメチル化コピー数をメチル化スコアとして数値化し評価しました。計算式はFisher法に従っております。計算式 =-2Σlog(1-φ((m-μ)/σ))

図2はexoDNA抽出後の濃度と断片長を示したものです。

図2. exoDNA抽出後の濃度と断片長(参考例)

図3. exoDNAのqMSP反応グラフ(5遺伝子・内在性コントロール) 参考例

結果
代表的な癌種と未病、健常者※3の血漿由来cfDNAとexoDNAの遺伝子プロモーターCpGアイランドのメチル化を調べた結果、1000コピーあたりのメチル化のコピー数は、AUCの結果から概ねの癌種においてほぼ同様のレベルでした。未病においてはTotal exosomeDNA(exoDNA)を用いた方が検出率が良い結果になりました。(図4と図5を参照)なお、膀胱がん、卵巣がん、胃がんなどの癌種においては症例数が少ないためにデータは省略しました。
※3:CTC数がゼロの健常者を指します。


図4. 血漿由来cfDNAの遺伝子プロモーターCpGアイランドの高メチル化

各癌種cfDNAのROC曲線(Receiver Operating Characteristic ) curve


図5.血漿由来exoDNAの遺伝子プロモーターCpGアイランドの高メチル化

各癌種Total exosomeDNA(exoDNA)のROC曲線(Receiver Operating Characteristic) curve

Hypercoolテクノロジー™で設計したHypercool-qMSP PPセット
⇒詳細はこちら


■提出条件

※本測定のご依頼に際しては弊社との共同研究契約が必要となります。専用採血管につきましては共同研究契約締結後、弊社より必要数をお送りします。

◇Cell-free DNA(cfDNA) Methylation Assayをご依頼の場合
弊社指定 Cell-Free DNA BCT®(Streck社製)10mlの採血管を使用。
・採血前の容器⇒冷蔵保存(4~10℃)
・採血直前⇒常温に戻す(15~30℃)
・採血後の容器⇒常温保存(15~30℃)

採血後すぐに、血液をゆっくりと10回転倒混和し、室温で保存ください。
採血後の冷蔵および冷凍保存は禁止となります。検体は採血後24時間以内に弊社必着。


◇Total exosomeDNA(exoDNA) Methylation Assayをご依頼の場合
弊社指定EDTK-3K 2mLの採血管を使用。
・採血前の容器⇒常温保存(15~30℃)
・採血後の容器⇒常温保存(15~30℃)

採血後すぐに、血液をゆっくりと10回転倒混和し、室温で保存してください。
検体は採血後24時間以内に弊社必着。


■受付日・時間帯

本測定は事前予約制です。
検体発送は弊社に祝祭日を除く平日の火曜日~金曜日、午前中必着。


■お問い合わせ

株式会社日本遺伝子研究所 CTCラボ
TEL:022-388-9741      FAX:022-388-9740
E-mail: ctc-lab@ngrl.co.jp

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