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小さなRNAが未来を切り拓く 

トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)は、血管新生を制御することが報告されています。血管新生は創傷治癒にだけでなく、慢性炎症や悪性腫瘍にも大きく関わる重要な因子であると考えられています。また、TGF-β シグナル伝達経路は多くの疾患の治療においても有望な標的と考えられているので、様々な戦略による薬物開発の標的となっており、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸医薬が現在進行形で多数開発されていると言います。

▶今回は、miR-148bに焦点を当てた文献をご紹介します。miR-148bがTGF-βシグナル伝達を調節し、内皮間葉転換において重要な役割を果たすことを実証しています。miR-148bの過剰発現は血管内皮細胞の移動や増殖および血管新生を増加させ、阻害は内皮間葉転換を促進すると言います。言い換えれば、前者は創傷血管新生を促進して治癒に向わせ、後者は創傷閉鎖を阻害したり炎症反応を促進したりするということになります。このようにmiR-148bが内皮間葉転換および血管新生を制御する重要な要素であることが明らかになったことから、筆者は、血管修復や組織修復におけるmiR-148bコントロールによる治療の道が開かれるだろうと展望しています。

Miscianinov, Vladislav, et al. “MicroRNA-148b Targets the TGF-β Pathway to Regulate Angiogenesis and Endothelial-to-Mesenchymal Transition during Skin Wound Healing.” Molecular Therapy (2018).

そのオリゴ合成、承ります!
文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

「miRNA mimic」「anti miRNA (miRNA inhibitor)」「siRNA」をはじめとしたRNAベースのオリゴヌクレオチド合成を承ります。また、RNAに各種修飾を施すことも可能ですので、ご相談ください。

 

クリックケミストリー

▶今回ご紹介するのは、イムノPCR法における抗体の検出を目的とした『抗体-DNAコンジュゲート』作製に関する文献です。コンジュゲート作製に用いられている一般的な方法は『ビオチン-ストレプトアビジン結合反応』です。しかし文献中において、その結合反応の煩雑さを解消するために『クリックケミストリー(アルキン-アジド)付加環化反応』が採用されています。銅イオンがタンパク質の変性を引き起こす可能性を考慮し、歪んだアルキンであるDBCOによる銅イオンフリーのクリック反応を用いています。この文献にある研究は、よりシンプルにコンジュゲートを得、さらにイムノPCR法における抗体の検出感度をアップさせるという目的で進められています。しかし現段階では、コンジュゲート作製プロトコルの簡略化以外の目的は、残念ながらまだ達成されていないというのが実状のようです。

Maerle, Artem V., et al. “Development of the covalent antibody-DNA conjugates technology for detection of IgE and IgM antibodies by immuno-PCR.” PloS one 14.1 (2019): e0209860.

クリックケミストリー反応はシンプルかつ高効率であることが最大のメリットです。今回ご紹介した文献では、検出感度をアップはできなかったものの、コンジュゲート作製プロトコルは大幅に簡略化することが可能となりました。クリックケミストリーを採用した結合反応の最適化という試みは、様々な分野で実行されています。従来方法の改善、新たな方法の確立に、クリックケミストリーを採用して検証されてみてはいかがでしょうか。

そのオリゴ合成、承ります!
文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

文献で登場したジベンゾシクロオクチン(DBCO)の場合、DBCOとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーをご選択いただくことができます(PEGリンカー、アルキルリンカー、セリノールリンカー等)。

クリックケミストリー歪み促進型Huisgen反応(SPAAC)用の歪んだアルキンを修飾したオリゴヌクレオチドの合成を承ります。DBCOだけでなく、ビシクロノニン(BCN)の修飾も可能です。また、銅イオンを触媒としたクリック反応(CuAAC)用のオリゴヌクレオチド合成も承ります。ラインナップを多数取り揃えておりますので、ホームページの掲載がない修飾でも、是非弊社に直接ご相談ください。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

DBCOだけでなく、各種ラインナップについても様々なリンカータイプを取り揃えております。ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もありますので、是非一度、ご相談ください。

『Spacer修飾オリゴDNA』

▶塩基を持たない構造体、スペーサー
オリゴDNAの5´や3´末端、インターナルに導入することができます。
多数のラインナップがあり、この中からスペーサーの長さやリンカー種を選択することができます。
また、いくつかのスペーサーを組み合わせることによって、スペーサーの長さやリンカー種をカスタ
マイズすることも可能です。(組み合わせ数が多数となる場合には、オリゴDNA合成効率を左右する
場合もありますので、直接ご相談ください。)

▶スペーサー修飾ラインナップ
Spacer C2, C3, C4, C6, C9, C12 
Spacer 9, 18

DNA鎖のホスホジエステル結合骨格中にスペーサーを導入する際に用います。配列内挿入は安定した脱塩基部位を導入するために用いられます。DNA鎖にヘアピン構造を持たせた場合のループ部分として利用したり、DNA鎖に疎水性部分を追加できるという報告もあります。また、3´にスペーサー修飾を施すことで、3 ´末端のエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を遮断することもできます。

Spacer C2, C3, C4, C6, C9, C12は炭素原子のスペーサーアームを持つアルキルリンカータイプです。Spacer 9, 18はPEGリンカータイプです。

dSpacer、エチニルdSpacer

塩基部を欠いたデオキシリボース環のみの構造です。変異誘発に関わる可能性があるとされているDNAの脱塩基部位ですが、非常に不安定です。天然の脱塩基部位の不安定さをテトラヒドロフラン誘導体により解消したオリゴDNA修飾がdSpacerです。塩基部を欠いているので、挿入された配列部分の二本鎖の安定性を和らげることができます。エチニルdSpacerは、通常のオリゴDNA鎖において塩基が結合している糖の1´位に、アルキン構造を持ちます。この部分を高効率でクリックケミストリー付加環化反応させることができ、Huisgen反応後には、付加環化反応により作られる1,2,3-トリアゾール環が、糖の1´位に位置する構造となります。

クリックケミストリー

一般的なHuisgen反応は、銅イオンを触媒として加速的に進みます(CuAAC)。反応自体がとてもシンプルなこと、反応条件が緩和であることなどが、その人気の秘訣です。ところがその半面、時に銅イオンの毒性による悪影響が懸念されることも事実です。元来は触媒として必要なものだと考えられていた銅イオン。しかし、これを使わないという究極の発想から誕生した『歪み促進型Huisgen反応(SPAAC)』は、今では多くの研究者にとって特殊なものではなくなりつつあります。

▶今回ご紹介する文献では、この歪み促進型Huisgen反応が採用されています。アジドやアルキン自体には毒性がないので、銅イオンを用いないことで反応自体の毒性の心配をする必要がなくなります。文献で登場しているのは、歪んだアルキンの中でも最も嵩の小さいビシクロノニン(BCN)です。

機能性を有するテーラーメードなコンジュゲートが設計できたという文献です。この文献ではタンパク質-ssDNAコンジュゲートを作製していますが、この結合にクリックケミストリー歪み促進型Huisgen反応(SPAAC)の技術を用いています。この文献で登場するオリゴヌクレオチドは、タンパク質を標的へデリバリーするためのツールとして用いられています。コンジュゲートの構造や機能上の問題、CuAACによるタンパク質構造への悪影響などを克服し、タンパク質の決められた残基へ特異的にssDNAを生体直交型反応させることで、ナノスケールアセンブリの機能を調整し、精度と制御力の向上を実現しています。

今後、非天然アミノ酸数のさらなる増加と、ssDNAの5’や3’やインターナル修飾の多様さとが相まって、この文献で登場したようなアプローチはさらに広い適用範囲を有する可能性を秘めているとの見解を示しています。

Marth, Gabriella, et al. “Precision templated bottom-up multiprotein nanoassembly through defined click chemistry linkage to DNA.” ACS nano 11.5 (2017): 5003-5010.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

歪み促進型Huisgen反応(SPAAC)用の歪んだアルキンを修飾したオリゴヌクレオチドの合成を承ります。文献で登場したビシクロノニン(BCN)だけでなく、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)の修飾も可能です。また文献では、各種修飾の5’、3’、インターナルラベルについても触れられています。それが可能なオリゴヌクレオチド修飾は多数あり、弊社ホームページでも一部を掲載しております。ホームページの掲載がない修飾でも、是非弊社に直接ご相談ください。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

ASOの薬物相互作用(2´MOE-RNA、 GalNAc) 編

ASO(アンチセンスオリゴヌクレオチド)療法を採用する際、多くの場合において他の治療方法との併用が必要となると言います。このとき、「ASOは他の治療薬の基質や阻害剤と成り得るのか?」「ASOの働きが阻害されることはあるのか?」…薬物相互作用は、核酸医薬を開発・評価する際には必ず考慮しなければならない要件です。

▶デリバリー戦略 ~ASOの薬物相互作用を評価~

2′-MOE-ASO(GalNAcとコンジュゲートされたASOを含む)を用い、薬物相互作用を評価した文献をご紹介します。3分岐型のGalNAcが結合したASOを用いた薬物相互作用研究は他では実施されておらず、また非コンジュゲートASOの場合も限られた数しか報告されていないと言います。

著者らは、ASOとCYP(シトクロムP450)の相互作用を検証しています。ASOはCYP阻害剤とはならず、小分子薬物を共投与した時も薬物相互作用は起こらなかったことが述べられています。また、ASO自体がCYPから影響を受けることもなかったと報告しています。治療の安全性および有効性を確実にするためにこの評価は非常に重要で、この評価によってASOの安全性プロファイルの信頼性が向上するとの見解を示しています。

Shemesh, Colby S., et al. “Assessment of the Drug Interaction Potential of Unconjugated and GalNAc3-Conjugated 2′-MOE-ASOs.” Molecular Therapy-Nucleic Acids 9 (2017): 34-47.

Pick-Up!!
『2'-MOE-RNA』『GalNAc』も登場

『2′-MOE』は、リボース2′位がO-methoxyethyl化された修飾です。代謝安定性の増加、標的結合の親和性増加に働き、また、2′-OMeと比較してヌクレアーゼ耐性がアップするという報告もあります。

『GalNAc』は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と高い親和性を持つ単糖類で、ASGPRを多く持つ肝細胞にオリゴヌクレオチドを送達するのに大変有効に働くと言います。今回ご紹介する文献では、GalNAc(3分岐)-ASOコンジュゲートが、非結合ASOと比較して20〜30倍以上の効力改善をもたらしたことが記されています。

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

2′-MOE-RNA挿入、GalNAcの末端修飾(複数個も可)を承ります。また、通常のリン酸結合(ホスホジエステル結合)だけでなく、S化結合(ホスホロチオエート結合)とすることも、さらにホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合のキメラ合成も可能です。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

GalNAc-siRNA-コンジュゲート 編

肝細胞は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)とよばれるガラクトースを強く認識するレセプターを持つことが知られています。ASGPRは、タンパククリアランスに関わる受容体です。N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)はガラクトースから誘導された単糖類なので、ASGPRと結合します。そのため、GalNAcとオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートもASGPRから肝細胞へ取り込まれていきますこのシステムを利用した核酸医薬品は、今も数多く開発されています。

▶デリバリー戦略 ~GalNAc-siRNA-コンジュゲートで肝細胞へ~

N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)をアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)が肝細胞へ取り込むことを利用した、GalNAc-siRNA-コンジュゲートについて述べられた文献をご紹介します。このコンジュゲートは効率よく肝細胞に運ばれASGPRに取り込まれるのですが、例えばASGPRの発現が減少するような疾患であっても、肝臓をターゲットとしたGalNAc-siRNA-コンジュゲートが有効に作用し、その効力は損なわれないということが報告されています。ASGPR発現は、肝硬変や癌などの肝疾患と診断された場合の肝機能の低下と臨床的に相関すると考えられているため、この文献により提示された結果は、とても有意義であると言えます。また文献では、さらに幅広く応用できる可能性をも有しているとの見解を示しています。

Willoughby, Jennifer LS, et al. “Evaluation of GalNAc-siRNA Conjugate Activity in Pre-clinical Animal Models with Reduced Asialoglycoprotein Receptor Expression.” Molecular Therapy 26.1 (2018): 105-114.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

siRNAの合成を承ります。脱保護し、アニーリング済みの2本鎖の状態でお届けします。また、siRNA へのGalNAc修飾をはじめとした各種修飾も可能です。GalNAcの場合は、末端への複数個修飾もできます。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

GalNAcの導入 編

▶N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)とは?

GalNAcは、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と高い親和性を示します。そのためGalNAcとオリゴヌクレオチドのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを肝細胞(ASGPRを多く持つ)へデリバリーするのに極めて有効に働きます。

▶オリゴヌクレオチドの「どこに」「どのように」GalNAc修飾を導入すれば良い?

5´末端もしくは3´末端にGalNAcを導入することで、デリバリー効果が得られるという報告があります。よく目にするのは、GalNAcをフォーク状に3分岐で結合させた形態です。弊社で化学合成できるのは、上図のように、一価のGalNAcをホスホジエステル結合で連なるように繋げた構造です。

ここで、文献を一つご紹介します。3分岐GalNAcは標的遺伝子の抑制に10〜60倍の効力の増強を示したことが述べられています。さらに3つでなくても、1つおよび2つのGalNAcをコンジュゲートした場合でも、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力増強に効果的であったとも報告しています。

Schmidt, Karsten, et al. “Characterizing the effect of GalNAc and phosphorothioate backbone on binding of antisense oligonucleotides to the asialoglycoprotein receptor.” Nucleic acids research 45.5 (2017): 2294-2306.

日本遺伝子研究所では、GalNAc修飾オリゴヌクレオチドの合成を承ります。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

GalNAcとはどんなもの? 編

▶N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)をオリゴヌクレオチドに導入できるようになりました。

この度、溶液相ではなく固相合成技術を採用することで、GalNAc修飾のオリゴヌクレオチド合成上の手順簡略化と迅速化が実現し、オリゴヌクレオチドのGalNAc修飾を新たに弊社のラインナップに加えることができました。

Cedillo, Isaiah, et al. “Synthesis of 5′-GalNAc-Conjugated Oligonucleotides: A Comparison of Solid and Solution-Phase Conjugation Strategies.” Molecules 22.8 (2017): 1356.

▶GalNAcとはどんなもの?

GalNAcは、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と結合する単糖類です。そのため、GalNAc はASGPRを多く持つ肝細胞へ集積し、このレセプターから肝細胞へ取り込まれます。

GalNAcと治療用オリゴヌクレオチドとのコンジュゲートを形成させることで、このコンジュゲートも肝細胞に高密度に存在するASGPRに結合し、肝細胞に取り込まれていきます。GalNAcに関して、効率よく肝細胞へ送達するためのデリバリーツールとして報告されている例が多数あります。

日本遺伝子研究所では、GalNAc修飾オリゴヌクレオチドの合成を承ります。

 

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

さまざまな核酸医薬の化学修飾とその送達系 編

特定の標的分子をターゲットとする治療方法は、非常に有用な治療戦略です。『より効率的な治療を』と、その期待は高まる一方です。ところが核酸医薬には、安全性、安定性、選択性、送達性、免疫性など、越えなければならない壁がたくさんあります。そして、数ある課題の中でも特に重要であると考えられているのが、安全かつ効率的なデリバリーシステムです。

▶デリバリー戦略 ~さまざまな核酸医薬のデリバリーを探る~

今回ご紹介するレビューでは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAやmiRNA、アプタマー、およびプラスミド等の核酸医薬に焦点を当て、その技術とその課題を提示しています。また核酸医薬について、さまざまな化学修飾とその送達系にも言及しています。親油性アップのためのコレステロール修飾やビタミンE修飾、肝細胞への送達効率改善のためのGalNAc修飾など、デリバリーを目的としたさまざまな化学修飾が紹介されています。

紹介されているような治療方法は未だ開発中ではあるものの、さまざまな種類のヒト疾患の治療に対して大変有用であると、その将来を見据えているレビューです。化学修飾を駆使した核酸医薬の送達系を構築するためのアプローチは、近い臨床応用に向け不可欠であると総括されています。

Chen, Changmai, Zhenjun Yang, and Xinjing Tang. “Chemical modifications of nucleic acid drugs and their delivery systems for gene‐based therapy.” Medicinal research reviews (2018).

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

siRNAやmiRNAをはじめとする短いRNA合成、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼに対する耐性を持たせるための『ホスホロチオエート結合(S化)』『2′-OMe』『2′-MOE』『2′-F』修飾などを承ります。その他にも、レビューに登場したコレステロール修飾をはじめとする親油性修飾、金ナノ粒子と結合させるためのチオール修飾、DNAデンドリマー作製のためのクリックケミストリー修飾や光架橋修飾など、ドラッグデリバリーを目的とするアプローチは多種多様です。これらのデリバリーのためのさまざまな化学修飾をオリゴDNAやRNAに結合させることが可能です。

リボース2′位修飾オリゴヌクレオチド 2′-MOE-RNA挿入

2′-O-メトキシエチルアンチセンスオリゴヌクレオチド(2’MOE‐ASO)核酸医薬標的RNAとの結合親和性上昇やヌクレアーゼ耐性の観点からリボース2′位修飾が注目されている昨今ですが、その中でも弊社では、『2’MOE』を特に重要視しています。近年、核酸医薬として承認されたものや製品化に向けて確実に前進しているものなどが急激に増えてきており、今後の展開に期待が持てます。今回は、注目の2’MOE‐ASOをヒトに投与した時の安全性を評価した3つの文献をご紹介したいと思います。これらは同じ著者によって系統的に調査されたものです。

 

 2’MOE‐ASOの総合的な安全性評価

 ASOの安全性を評価している文献です。ASOは多くの疾患の治療において有用であると言われていますが、場合によっては高用量の投与を要するケースもあり、投与部位も治療期間も様々です。また、ASOの化学修飾・構造・分子量なども様々なので、広範にわたり全てを網羅した分析を行うには限界があると言います。そのような中でこの文献では2’MOE‐ASOに着目し、腎臓および肝機能、血液学および補体活性化に関して安全性シグナルの発生率によって安全性を評価しています。

Crooke, Stanley T., et al. “Integrated safety assessment of 2′-O-methoxyethyl chimeric antisense oligonucleotides in nonhuman primates and healthy human volunteers.” Molecular Therapy 24.10 (2016): 1771-1782

2’MOE‐ASOの血小板への影響

次に、2’MOE‐ASO投与による血小板減少の有無について、臨床試験データの徹底的な分析を行った文献をご紹介します。2’MOE‐ASO治療では臨床的に有意でない血小板低下が見られたケースもありましたが、血小板数および機能に有意な影響は見出されていないと報告しています。

Crooke, Stanley T., et al. “The effects of 2′-O-methoxyethyl containing antisense oligonucleotides on platelets in human clinical trials.” Nucleic acid therapeutics 27.3 (2017): 121-129.

2’MOE‐ASO投与による腎機能障害

最後にご紹介するのは、2’MOE‐ASO投与による腎機能障害の発生について調査した文献です。ここでは、プラセボ薬・ASO核酸医薬を投与した場合とで比較し、腎機能の変化を検証しています。注目すべきことに、腎機能障害に関する臨床的に有意な証拠は見出されなかったと報告しています。

Crooke, S. T., et al. “The Effects of 2′-O-Methoxyethyl Oligonucleotides on Renal Function in Humans.” Nucleic acid therapeutics 28.1 (2018): 10-22.

 そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

「miRNA mimic」「anti miRNA (miRNA inhibitor)」「siRNA」をはじめとしたRNAベースのオリゴヌクレオチド合成を承ります。また、今回ご紹介した文献で登場した「2’-MOE-RNA」を配列内に挿入することも可能です。オリゴヌクレオチドのリン酸酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート化(Sオリゴ)によりヌクレアーゼ耐性を増加させることもできます。ギャップマータイプの2’MOE‐ASOの合成も可能です。

リボース2′位修飾オリゴヌクレオチド

2′-MOE-RNA挿入合成をはじめました!

2′-O-methoxyethyl(2′-MOE)はリボース2′位修飾の1つです。ヌクレアーゼ耐性や標的RNA配列との結合親和性向上に働くと言われています。今回は、アンチセンスオリゴヌクレオチドへの挿入例をご紹介します。

▶miR-10bアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤として、ホスホロチオエート骨格を有する2′-MOEオリゴヌクレオチドを使用した例を紹介しています。

Teplyuk, Nadiya M., et al. “Therapeutic potential of targeting microRNA‐10b in established intracranial glioblastoma: first steps toward the clinic.” EMBO molecular medicine 8.3 (2016): 268-287.

▶さまざまなmiRNA治療戦略とデリバリー上の課題について説明しているレビューです。2′-MOEについても少し触れています。

Fernandez-Piñeiro, I., I. Badiola, and A. Sanchez. “Nanocarriers for microRNA delivery in cancer medicine.” Biotechnology Advances (2017).

▶2′-MOE修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド投与による血小板減少のメカニズムについて、研究結果を発表した文献です。

Narayanan, P. K., et al. “Investigation into the mechanism (s) that leads to platelet decreases in cynomolgus monkeys during administration of ISIS-104838, a 2ʹ-MOE-modified antisense oligonucleotide.” Toxicological Sciences (2018).

▶ホスホロチオエート結合アンチセンスオリゴヌクレオチド(PS-ASO)の細胞内取り込みと輸送に関する文献です(解明されていない事柄がまだまだ多く存在するとのことです)。効力および薬物動態特性を増強するための「糖の2’位の修飾」の一例として、2′-MOEが登場しています。

Crooke, Stanley T., et al. “Cellular uptake and trafficking of antisense oligonucleotides.” Nature biotechnology 35.3 (2017): 230.

急速な進歩を遂げているアンチセンスオリゴヌクレオチド治療。ギャップマー型PS-ASO(DNA鎖5~10merの両端に、リボースの2 ‘位を修飾した塩基2~5 merを配し、ホスホロチオエート化する)を取りあげています。

Miller, Colton M., et al. “Endosomal Escape of Antisense Oligonucleotides Internalized by Stabilin Receptors Is Regulated by Rab5C and EEA1 During Endosomal Maturation.” nucleic acid therapeutics 28.2 (2018): 86-96.

日本遺伝子研究所では、アンチセンスオリゴやmiRNAの合成を承ります。

▶『LINE-1プライマー・プローブセット』『LINE-1プライマーセット』は、Cell Free DNA(cfDNA)濃度をリアルタイムPCRによって評価することができる製品です。

LINE-1は、long interspersed nuclear element(LINE)と呼ばれる自律性トランスポゾンの一つです。かつては、ノンコーディングDNAの部類に属する「ジャンクDNA」であると考えられていました。ヒトゲノム中ではその配列が豊富に存在し、ヒトゲノムの17%を構成、ゲノムあたり約520,000コピーを有します。

▶このLINE-1を定量リアルタイムPCRのターゲットとし、血漿・血清中のCell Free DNA濃度を評価している文献をご紹介します。

弊社で『LINE-1 PPセット』『LINE-1 Pセット』としてご提供しているものです。

Rago, Carlo, et al. “Serial assessment of human tumor burdens in mice by the analysis of circulating DNA.” Cancer research 67.19 (2007): 9364-9370.

弊社のセットとは配列が異なりますが、この文献のようなセット以外の配列をご希望の場合には、カスタム合成として承ることができますので、ご相談ください。

Sunami, Eiji, et al. “Quantification of LINE1 in circulating DNA as a molecular biomarker of breast cancer.” Annals of the New York Academy of Sciences 1137.1 (2008): 171-174.

製品番号:500201 LINE-1 PPセット(プライマー・プローブセット)
製品番号:500202 LINE-1 Pセット(プライマーセット)

※本製品は受注生産品です。
※販売元は日本ジェネティクス株式会社です。
ご注文は、製品番号を添えて日本ジェネティクス株式会社へお願いします。

 

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

Au-S結合/デコイdsDNA-金ナノ粒子編

STAT(Signal transducers and activators of transcription)はシグナル伝達性転写因子です。細胞外からの情報を核へと運び、遺伝子に対して直接働きかけることでその発現を活性化させる、いわば細胞の運命をコントロールするタンパク質です。STATファミリーのひとつであるSTAT3は、細胞増殖や生存、細胞老化、細胞癌化について特に重要な役割を持っています。このSTAT3をうまく制御することで、様々な癌の発癌や悪性化の制御につながるだろうと考えられています。

▶デリバリー戦略 ~Au-S結合で『デコイdsDNA-ヌクレオリンアプタマー-金ナノ粒子』コンジュゲート~

今回ご紹介するのは、STAT3標的オリゴヌクレオチド(ODN)薬物の全身送達を目的としたシステム構築を成功させたという文献です。

これまで、STAT3デコイ(STAT3d)によるSTAT3活性化の阻止は積極的に検討されてきました。ところが、それにもかかわらず臨床応用が思うよう進まないのは、有効な全身送達システムが構築されていないことが理由であると筆者は言います。

この文献では、頭頸部癌(HNC)の治療標的としてSTAT3に着目し、STAT3デコイ(STAT3d)にデリバリーのための金ナノ粒子(AuNP)、頭頸部癌細胞表面特異性のためのヌクレオリンアプタマー(NUAP)をAu-S結合で連結させることによって『AuNP-NUAP-STAT3d』を生成しています。

このコンジュゲートによって、STAT3d送達のための手段として、そして頭頸部癌の併用療法のための放射線増感剤として、効率的な治療効果をもたらすことが実証されたと報告しています。

Zhang, Surong, et al. “Dual radiosensitization and anti-STAT3 anti-proliferative strategy based on delivery of gold nanoparticle-oligonucleotide nanoconstructs to head and neck cancer cells.” Nanotheranostics 2.1 (2018): 1.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!5´や3´末端にアミノやチオールを修飾したオリゴDNA・RNAの合成を承ります。また、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換させたホスホロチオエート化(Sオリゴ)により、ヌクレアーゼ耐性を増加させることもできます。ホスホロチオエート化は全塩基間に導入することもできますが、文献にも登場したように、一部の塩基間へのみ導入(Sオリゴキメラ)することも可能です。

日本遺伝子研究所では、アンチセンスオリゴやアミノ化・チオール化をはじめとする各種修飾を承ります。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

クリックケミストリー/AAVキャプシド編

二つの分子を簡単に結合することができるクリックケミストリー。『銅イオンを触媒とするクリックケミストリーHuisgen反応(CuAAC)』が一般的によく用いられるのは、pHに依存せず反応溶媒を問わない、反応効率が良い、特異的に反応する、反応が至ってシンプルなどの理由からです。

デリバリー戦略 ~Huisgen反応で『オリゴヌクレオチド‐AAVキャプシド』コンジュゲート~

有効なドラッグデリバリーシステム(DDS)の構築は、核酸医薬の分野では切に望まれている大きな課題です。急速な分解や免疫機構などに立ち向かい、『必要な薬剤を、必要な場所へ、必要な時に、必要な量を』的確に送達することは、極めて重要なことと言います。

様々なデリバリー媒体がありますが、今回着目するのは『アデノ随伴ウイルス(AAV)』です。ご紹介する文献では、AAVの課題(輸送容量・指向性・組織特異性が制限されること、免疫原性の問題など)を克服したことが報告されています。ウイルスの動向や特性をうまく利用し、DNAアプタマーの特性を利用して組織特異性を持たせ、さらに中和抗体による送達効率低下を防ぐことに成功した『オリゴヌクレオチド・AAVキャプシド・エンジニアリングシステム』は、クリックケミストリーの技術を用いて構築されています。

さらに興味深いのは、今回構築されたプラットフォームは、キャプシドのエンジニアリングアプローチの利点と、DNAナノテクノロジー手法の可能性を併せ持つということです。ここから、さらに幅広い応用が見出されることが期待されます。

Katrekar, Dhruva, et al. “Oligonucleotide conjugated multi-functional adeno-associated viruses.” Scientific Reports 8.1 (2018): 3589.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

オリゴヌクレオチドの末端をアルキン修飾することができます。必要であれば、インターナル修飾(配列内修飾)することも可能です。また、文献内に登場した歪んだアルキンであるジベンゾシクロオクチン(DBCO)やビシクロノニン(BCN) をオリゴヌクレオチドに修飾することも可能です。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

『オリゴヌクレオチドのデリバリー戦略』

クリックケミストリー編

二つの分子を簡単に結合することができるクリックケミストリーは、緩和な反応条件や反応効率、簡便さなどから、その汎用性を高く評価されています。また合成オリゴヌクレオチドは、治療薬として主要な構成要素であると捉えられています。

▶デリバリー戦略 ~クリックケミストリーHuisgen反応でコンジュゲート~

今回ご紹介するのは、現在見出されている、治療開発におけるクリックケミストリーの有用性が明記されたレビューです。

治療に際し、標的へのデリバリー効率や分解などの大きな壁が立ちはだかっていると言います。一般的に、治療におけるオリゴヌクレオチドを用いたコンジュゲートは、治療剤のデリバリーが効率よくスムーズに行なわれるためにとても有用であると言います。このレビューでも、オリゴヌクレオチドを用いた治療剤の条件として、①標的に対し効率的な塩基対を確実に形成すること ②安定性および細胞標的特異性を持つこと ③適切なデリバリー担体を見出すこと ④標的特異性をアップさせることが重要であると述べられています。クリックケミストリー技術を用いてオリゴヌクレオチドと他の生体分子とを結合させることによって、このような条件を満たすことができる可能性を示しています。

Astakova, Kira, et al. ““Clicking” gene therapeutics: A successful union of chemistry and biomedicine for new solutions.” Molecular pharmaceutics (2018).

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

「HypercoolテクノロジーTM」 qPCR法の新たな技術がここに誕生!

短いDNA・RNAの検出を可能にするHypercoolテクノロジーTM

Application example 

血中循環 腫瘍由来メチル化DNA定量アッセイの可能性拡大に

ctDNAのターゲットの一つに腫瘍に関連したメチル化異常がありますが(文献6)、これをqPCRで特異的に定量する場合、バイサルファイト処理後のメチル化CpGに特異的なプライマープローブを設計する必要があります。(quantitative methylation specific PCR法, qMSP法)

しかしながら、バイサルファイト処理したDNAはnon-CpGのシトシンがウラシルに変換されることにより、プライマーやプローブのTm値が低下し、シグナルが弱くなることがあります。

また、Tm値を高くするためにプライマーやプローブ長を長くする場合、その分だけ特異性が低下し、非メチル化DNAを検出してしまうことがあります。

HypercoolテクノロジーTMにより、qMSPプライマーやプローブのTm値を上げ、短いプライマー/プローブ長にすることができます。このことにより、qMSPのプライマープローブ設計の可能性を広げ、qMSPの性能向上が期待できます。

(文献)

Warton K et.al. Methylated circulating tumor DNA in blood: power in cancer prognosis and response,  Endocr Relat Cancer. 2016 Mar;23(3) :R157-71

日本遺伝子研究所は、感度および信頼性を向上させるHypercoolテクノロジー™によって、皆さまの研究をサポートいたします。

「HypercoolテクノロジーTM

短いDNA・RNAの検出を可能にするHypercoolテクノロジーTM

Tm値上昇塩基を各種オリゴDNAに導入することで、従来よりもプライマー・プローブや増幅サイズを短くでき、「感度がいまひとつ」「ターゲットがATリッチ」「ターゲットの領域が狭い」「ローブのジェノタイピングの分解能が低い」などでお困りの場合、性能向上や改善が期待されるという特長があります。

今回も引き続き、応用例をご紹介したいと思います。

Application example 

血中循環遊離DNA中の腫瘍由来 融合遺伝子の検出に

血中に循環している腫瘍由来の遊離DNA(circulating tumor DNA (ctDNA))の量ががんの予後や再発に関連していることが多くの論文で示唆されています。

ctDNAのターゲットとして、腫瘍由来の変異やメチル化異常の他に、融合遺伝子がありますが、卵巣がんや乳がんでは、既に融合遺伝子をターゲットとしてctDNA量を定量する例がいくつか報告されています(文献4,5) 。

原発巣組織から次世代シークエンスにより同定された患者特有の融合遺伝子配列をターゲットとするため、1塩基の変異を検出する場合よりもアーティファクトが生じにくく、アッセイの特異性や感度が高いといわれています。一方、ctDNAは血中で短く断片化して存在していることが多く、qPCRやdigital PCRで定量を行う場合、断片化による感度低下を防ぐ工夫が必要となります。

HypercoolテクノロジーTMにより、アンプリコンサイズを極限まで短くすることで、短く断片化しているターゲットをより多く検出できることが期待できます。

(文献4)

Faye R. Harris et.al. Quantification of Somatic Chromosomal Rearrangements in Circulating Cell-Free DNA from Ovarian Cancers, Scientific Reports 6, Article number: 29831 (2016)

(文献5)

Eleonor Olsson et.al. Serial monitoring of circulating tumor DNA in patients with primary breast cancer for detection of occult metastatic disease, EMBO Mol Med.  2015 Aug; 7(8): 1034-1047.

日本遺伝子研究所は、感度および信頼性を向上させるHypercoolテクノロジー™によって、皆さまの研究をサポートいたします。

「HypercoolテクノロジーTM

短いDNA・RNAの検出を可能にするHypercoolテクノロジーTM

< 特長 >
⇒Tm値上昇塩基を用いて、従来よりもプライマー・プローブや増幅サイズを短くできる。
⇒各種オリゴDNAに導入することができる。

特にダブルラベルプローブでは、汎用性の高い蛍光およびクエンチャーをご選択でき、ほぼすべての機器に適応可能。

⇒感度がいまひとつ、ターゲットがATリッチ、ターゲットの領域が狭い、プローブのジェノタイピングの分解能が低い…などでお困りの場合、性能向上や改善が期待される。

HypercoolテクノロジーTMには、このようにたくさんのメリットがあります。

Application example 

SNP GenotypingやRare mutation 解析のパフォーマンス向上に

がん研究において、循環する核酸バイオマーカーは非常に重要で、様々な課題を乗り越えることでさらに発展することが期待される分野です (文献1) 。

その課題の一例として、qPCRによるSNP Genotypingやdigital PCRによるRare mutation解析において、ターゲットによってはプローブが長鎖となってしまうことがあり、この原因からシグナル/ノイズ比が低くなったり、1塩基相違の分解能が低下したりと、パフォーマンスに悪影響を及ぼすことがあります。

しかし、HypercoolテクノロジーTMでは、Tm値上昇塩基の導入によりプローブの鎖長をコントロールすることが可能となります。鎖長の短いプローブではクエンチャーの効果がより強められ、ベースラインのノイズを最小限に抑えることができます。 さらに、1塩基相違のターゲットとの間のTm値をより低下させることで、両アレル間の分解能を向上させることができます。このような課題克服のためのひとつのツールとして、HypercoolテクノロジーTMは極めて有用であると言えます。

(文献1)

Rapisuwon, Suthee, Eveline E. Vietsch, and Anton Wellstein. “Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment.” Computational and structural biotechnology journal 14 (2016): 211-222.

Application example 

FFPEサンプルの遺伝子発現定量アッセイの向上に

FFPE病理組織中の核酸は断片化や化学修飾が進行しているため、RT-qPCRで遺伝子発現解析を行なう際は、サンプル調製、逆転写およびqPCRの各ステップで、特別な工夫が必要となります(文献2,3)。qPCRのステップで効果を発揮するのが、 HypercoolテクノロジーTMです。FFPE組織中ではRNAが100base以下に断片化していることがあり、遺伝子発現解析を安定して行うには、qPCRのアンプリコンサイズをできる限り短く設定することが重要となります。

(文献2)

Janine Antonove, et al. Reliable gene expression measurements from degraded RNA by quantitative real-time PCR depend on short amplicons and a proper normalization, Laboratory Investigation, 85, pages 1040–1050 (2005)

(文献3)

Natalie Ludyga, et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses, Virchows Archiv (2012), 460, Issue 2, pp 131–140

日本遺伝子研究所は、感度および信頼性を向上させるHypercoolテクノロジー™によって、皆さまの研究をサポートいたします。

付加環化反応で新たな『モノ』を創りだす

「クリックケミストリー」

アプタマーは、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大きく分類されます。核酸アプタマーは、免疫原性が低いこと、核酸の修飾によって安定性を制御できること、特異性や親和性が高いことのほか、化学合成できるという特長も持っており、幅広く研究されています。また自己組織化単分子膜(SAM)は、分子の自己集積化により形成される単分子膜の持つ高い分子配向性や安定性、表面の官能基によるさまざまな機能導入など、有効な基盤技術として期待されています。

▶クリックケミストリーの技術を用いて、オリゴペプチド自己組織化単分子膜(SAM)に核酸アプタマーをコンジュゲートしたという文献をご紹介します。このコンジュゲートによって、混合サンプルから標的細胞の単離と濃縮を行うため、SAMを利用した『Catch:選択的細胞捕捉』『Release :SAMの電気化学反応による標的細胞脱離』を成功させています。この結果は、基礎的な癌研究から組織工学への応用に至るまで、様々な研究分野における有望なツールと成り得ることを報告しています。

Enomoto, Junko, et al. “Catch-and-Release of Target Cells Using Aptamer-Conjugated Electroactive Zwitterionic Oligopeptide SAM.” Scientific Reports 7 (2017): 43375.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

文献で用いているのは、5´末端をアルキン修飾(セリノールリンカー)したオリゴヌクレオチドです。応用編として、セリノールではなくアルキルリンカーを導入することも可能ですし、塩基や糖からアルキンを伸ばすこともできます。日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

付加環化反応で機能性分子を創りだす

「クリックケミストリー」

5-ホルミル-2′-デオキシシトシン(fdC)は、近年になって発見されたエピジェネティック塩基です。その機能については未知の部分が多く、解明が期待されています。エピジェネティック塩基fdCの機能を理解するためには、特定のゲノム部位における「形成および除去」を分析することが重要であると言います。

▶今回ご紹介する文献では、クリックケミストリーを用いて配列特異的な誘導体を作製し、デジタルPCRと組み合わせることでfdCの「形成および除去」を分析することが可能となったと発表しています。この方法では、プローブとなるオリゴヌクレオチドに2′-O-プロパルギルウリジンを組み込み、Huisgen反応(クリック反応)を用いてアジド-C4-ヒドロキシルアミンを結合させることで、良い結果が得られたことを報告しています。

Su, Meng, et al. “5‐Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.” Angewandte Chemie International Edition 55.39 (2016): 11797-11800.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

オリゴヌクレオチドを合成する際に、指定の位置に2′-O-プロパルギルウリジンを挿入することができます。rUの他にも、rA、rG、rCの挿入も可能なので、プローブデザインの幅も広がります。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

また、今回ご紹介した文献とは直接の関係性はありませんが、4つのエピジェネティック塩基である5-メチルシトシン(5m-dC)、5-ヒドロキシメチルシトシン(5hm-dC)、5-ホルミルシトシン(5f-dC)、および5-カルボキシシトシン(5ca-dC)を配列内に挿入したオリゴヌクレオチドの合成も承っております。

HypercoolテクノロジーTMは、短いDNA・RNAの検出を可能にする技術です。

< 特長 >

▶Tm値上昇塩基を用いて、従来よりもプライマー・プローブや増幅サイズを短くできる。

▶各種オリゴDNAに導入することができる。

特にダブルラベルプローブでは、汎用性の高い蛍光およびクエンチャーをご選択でき、ほぼすべての機器に適応可能。

▶感度がいまひとつ、ターゲットがATリッチ、ターゲットの領域が狭い、プローブのジェノタイピングの分解能が低い…などでお困りの場合、性能向上や改善が期待される。

SNP GenotypingやRare mutation 解析のパフォーマンス向上、FFPEサンプルの遺伝子発現定量アッセイの向上、血中循環遊離DNA中の腫瘍由来 融合遺伝子の検出、血中循環 腫瘍由来メチル化DNA定量アッセイの可能性拡大などに、HypercoolテクノロジーTMは大変有用です。

日本遺伝子研究所は、感度および信頼性を向上させるHypercoolテクノロジーTMによって、皆さまの研究をサポートいたします。

核酸の修飾塩基【N6-メチルアデノシン編】 生命活動を支える塩基修飾

▶ご存知ですか?

核酸の修飾塩基をオリゴヌクレオチドの配列中に導入できます!

種類が100を超えると言われるRNAの転写後修飾ですが、その中のいくつかの種類は、オリゴヌクレオチドの配列中に化学的に導入することができます。例えば、メチル化、シュードウリジン化、脱アミノ化、チオ化など…。導入できる有名な修飾塩基はたくさんあります。

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さて、そもそも修飾塩基とはどのようなものなのでしょう。今回は、特に有名なN6-メチルアデノシンに焦点をあてたいと思います。

▶N6-メチルアデノシンって!?

細胞分化、胚発生およびストレス応答などを運命付けると言われるN6-メチルアデノシン。植物や脊椎動物だけでなく、細菌や酵母などの単細胞生物、ウイルスにも広く存在する修飾です。ところがN6-メチルアデノシンの機能や役割に関する解明が急激に行われはじめたのは、ここ数年のことのようです。

では、N6-メチルアデノシンは具体的にどのような働きをするのでしょうか。現在解明されているN6-メチルアデノシンの機能について述べられたレビューをご紹介します。mRNAの代謝調節、核のプロセシングとmRNAの輸送促進、mRNA翻訳促進など、様々な働きが記載されています。ただ、完全解明までにはより詳しい研究の余地がまだまだ残されているとの記述もあり、これから先も研究が押し進められていくであろうと展望しています。また、現在分かっていない転写後修飾もまだまだ存在し、今後も発見されるだろうことも示唆しています。

Zhao, Boxuan Simen, Ian A. Roundtree, and Chuan He. “Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 18.1 (2017): 31.

▶修飾塩基をもっと知るために

N6-メチルアデノシンを例に挙げましたが、修飾塩基にはそのはたらきの解明が十分になされていないものが他にもたくさんあります。定量分析や機能解析などを行う際に、修飾塩基が導入されたオリゴヌクレオチドを使用することがしばしばあるようです。一例をご紹介します。

シュードウリジンの定量分析

Yamauchi, Yoshio, et al. “A mass spectrometry-based method for direct determination of pseudouridine in RNA.” Nucleic acids research 44.6 (2016): e59-e59.

N6-メチルアデノシンの役割・効果の調査

Choi, Junhong, et al. “N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation elongation dynamics.” Nature structural & molecular biology 23.2 (2016): 110.

日本遺伝子研究所では、配列中に『修飾塩基』を挿入したオリゴDNA・RNAの合成を承ります。

▶イノシン(inosine) ▶5-メチルシトシン(5-me-C) ▶5-メチルウリジン(5-me-U)(T)
▶N6-メチルアデノシン (N6-me-A)  ▶1-メチルアデノシン(1-me-A)
▶シュードウリジン(Pseudouridine) ▶1-メチルシュードウリジン(1-me-Pseudouridine)
▶5-ブロモウリジン(5-Br-U) ▶5-ヨードウリジン(5-I-U) 
▶6-チオグアノシン(6-thio-G) ▶4-チオウリジン(6-thio-U)
▶2-アミノプリン(2-Aminopurine)
▶2,6-ジアミノプリン(2,6-Diaminopurine)(2-amino-A)
…他、ご相談も承ります。


小さなRNAが未来を切り拓く

今回ご紹介するのは、miRNAデリバリーに関するとても分かりやすいレビューです。さまざまなmiRNA治療戦略とデリバリー上の課題について説明しています。癌治療のためにこれまで開発されたマイクロRNA(miRNA)送達のナノシステムについてもカバーしています。また、本レビューでは、癌医療に関連する「最近のmiRNAナノキャリア」「ナノ担体に関連しているmiRNAの機能」について、一覧で表記されています。

そもそもmiRNAは、ヌクレアーゼによって迅速に分解され、腎排泄によって消失してしまいます。さらに、RNA投与は自然免疫応答を誘導し、望ましくない毒性を引き起こします。また、親水性、負電荷、高分子量などの理由により核酸の細胞膜通過が困難となることも併せると、総合的に見てもmiRNAの送達は非常に大きな課題であると述べられています。同時に複数のmiRNAを送達すること、miRNAと他の治療法との組み合わせることによって、癌の異種性に対処し、miRNA治療が大きく進展できる可能性を示唆しています。

Fernandez-Piñeiro, I., I. Badiola, and A. Sanchez. “Nanocarriers for microRNA delivery in cancer medicine.” Biotechnology Advances (2017).

癌による死亡者数や罹患者数を考えると、その治療の急速な発展は、まさに切望されていると言えます。miRNAの特性を生かしたナノメディシンの癌治療への応用は、今後ますます注目されていくことでしょう。

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

miRNA機能を調節するために、「合成miRNAを用いてmiRNA活性を回復」「anti miRNAオリゴヌクレオチド(AMO)を介してmiRNAの機能を阻害」という2つの治療アプローチが用いられています。このアプローチに用いられる短いRNA合成はもちろんのこと、レビュー内で登場した「2’-OMe」「2’-F-RNA」「2’-O‐Moe」を配列内に挿入することも可能です。また、リン酸酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート化(Sオリゴ)によりヌクレアーゼ耐性を増加させることもできます。

日本遺伝子研究所では、アンチセンスオリゴやmiRNAの合成を承ります。

小さなRNAが未来を切り拓く

極めて悪性な腫瘍の一つと認識されているグリオブラストーマ。その悪性度の高さ、予後が不良であることから、世界中で研究されており、効果的な治療方法の確立が急務であると言われています。

▶▶発癌性miRNAと言われるmiR-10bは、グリオブラストーマにおいて高度な発現が見られるとの報告があります。またmiR-10bを阻害することで、神経膠腫細胞の増殖および生存が強く損なわれると言います。

今回ご紹介する文献では、これまで明らかにされていなかったグリオブラストーマにおけるmiR-10bが維持されるメカニズムについて、その阻害を評価しています。またそれと同時に、グリオブラストーマに対するmiR-10b阻害の治療効果の評価も行なっており、本文献で提唱されている方法は、すべてのサブタイプに対して潜在的に有効であると報告しています。その際にmiR-10bアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤(ASO)として、ホスホロチオエート骨格を有する2′-O-methoxyethylオリゴヌクレオチドを使用しています。

Teplyuk, Nadiya M., et al. “Therapeutic potential of targeting microRNA‐10b in established intracranial glioblastoma: first steps toward the clinic.” EMBO molecular medicine 8.3 (2016): 268-287.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!

オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を持たせるためのホスホロチオエート化(S化)、一般的な骨格であるホスホジエステル、およびこれらの混合骨格(Sキメラ)を有し、2′-O-methoxyethylを挿入したオリゴヌクレオチドを合成します。

日本遺伝子研究所では、アンチセンスオリゴやmiRNAの合成を承ります。2’-OMeや2’-F-RNA、2’-O‐Moeの挿入も承りますので、お気軽にご相談ください。

『Cell Free DNA 濃度評価用リアルタイムPCR製品』をラインナップ

前回、予定をお伝えいたしましたとおり、この度ラインナップいたしましたリアルタイムPCR機器を用いてCell Free DNA(cfDNA)濃度を便宜的に評価することができる「リアルタイムPCR製品」の内容をご紹介いたします。

~ LINE-1配列を用いたPCR ~

LINE-1はかつて「ジャンクDNA」と呼ばれた、いわゆる「ノンコーディングDNA」の部類に属していて、long interspersed nuclear element(LINE)と呼ばれる自律性トランスポゾンの一つです。LINE-1はヒトゲノム中で豊富な配列の一つで、ヒトゲノムの17%を構成し、ゲノムあたり約520,000コピーを有します。このLINE-1を定量リアルタイムPCRのターゲットとして、血漿・血清中の低濃度のCell Free DNA濃度を評価しているいくつかの報告があります。

以下をクリックすると製品詳細をご覧いただけます。

【受注生産品】
製品番号:500201 LINE-1 PPセット(プライマー・プローブセット)
製品番号:500202 LINE-1 Pセット(プライマーセット)

販売元:日本ジェネティクス株式会社
ご注文は、製品No.を添えて、日本ジェネティクス株式会社へお願いします。

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

今回は、『オリゴヌクレオチドでアプタマー作製』したという文献をご紹介したいと思います。

▶核酸アプタマーとは、極めて高い親和性を持ち、特異的に標的分子に結合する短い一本鎖オリゴヌクレオチドです。タンパク質やペプチド、小分子から細胞に至るまでのあらゆるものを標的として抗体の代替物とみなされますが、抗体とは対照的に、アプタマーは低免疫原性かつ熱安定性であることが特長です。

今回ご紹介する文献では、この多用途性に着目し、様々な改変アプタマーについて議論されています。

Pfeiffer, Franziska, et al. “Customised nucleic acid libraries for enhanced aptamer selection and performance.” Current Opinion in Biotechnology 48 (2017): 111-118.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!類似のクリックマーの合成には、『C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾』や『エチニル(dA,dU)修飾』挿入オリゴヌクレオチドをオーダーください。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

▶今回は、C8アルキンdT(オクタジニルdU)修飾オリゴDNAを用いて、『siRNA-ペプチドコンジュゲート』作製が効率的に行われたという文献をご紹介したいと思います。

多くの可能性を持っていると言われる『siRNA-ペプチドコンジュゲート』。これまでは調製が困難であると考えられてきましたが、本文献ではクリックケミストリーを用いることで課題を克服しています。siRNAセンス鎖の5´末端をオクタジニルdU修飾し、ペプチドとクリック結合させています。これを用いることで腫瘍細胞内にsiRNAを選択的に送達することができ、HER2+癌細胞株における遺伝子サイレンシングに成功したと報告しています。

Gandioso, Albert, et al. “Efficient siRNA–peptide conjugation for specific targeted delivery into tumor cells.” Chemical Communications 53.19 (2017): 2870-2873.

そのオリゴ合成、承ります!

文献のアプリケーション応用には、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドをお勧めします!センス鎖の5´末端をC8アルキン(オクタジニル)修飾したsiRNAをオーダーしてください。この合成したsiRNAとクリック反応する相手は、ペプチド側のアジドです。

▶日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
・アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
・アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
・2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
・3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
・C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
・エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
・エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
・ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
・ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

▶今回は、O-プロパルギル修飾オリゴDNAを用いて2本鎖の結合を強固にしたという文献をご紹介したいと思います。

▶この文献では、オリゴヌクレオチドのリボース部分の2 ‘または3’位をプロパルギル修飾(アルキン構造)とすることで、Cu(I)触媒アジド – アルキン “ビス – クリック”反応により内部糖架橋を導入、平行鎖配向を有するオリゴヌクレオチドを作成したことを報告しています。このような平行ハイブリダイゼーションは、新しいオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、アンチセンス構築物またはナノデバイスを設計するための新しいツールとなり、DNAの多形性は、材料科学からDNA診断および医学への広範な応用を見出すDNAベースのナノ構造を構築する多数の機会を提供するだろうと述べられています。

Pujari, Suresh S., and Frank Seela. “Parallel stranded DNA stabilized with internal sugar cross-links: Synthesis and click ligation of oligonucleotides containing 2′-propargylated isoguanosine.” The Journal of organic chemistry 78.17 (2013): 8545-8561.

 

文献のアプリケーション応用は、日本遺伝子研究所のオリゴヌクレオチドで

オリゴヌクレオチドのリボース部分の2’または3’位がアルキン構造をもつ『2´-O-プロパルギル修飾』または『3´-O-プロパルギル修飾』がお奨めです。二本鎖の対となる塩基をこの修飾に置き換えてデザインし、オーダーしてください。

▶日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

クリックケミストリーHuisgen反応用『ヌクレオチドのアルキン修飾シリーズ』を、新たにラインナップしました。

▶糖の2´または3´位に、アルキン構造が結合しているタイプ(rA,rG,rC,rU)
2´-O-プロパルギル修飾オリゴDNA・RNA
3´-O-プロパルギル修飾オリゴDNA・RNA

▶塩基部に、リンカーを介してアルキン構造が結合しているタイプ(dA,dC,dU)
C8アルキン(オクタジニル)修飾オリゴDNA・RNA

▶塩基部に、リンカーを介さず直接アルキン構造が結合しているタイプ(dA,dU)
エチニル修飾オリゴDNA・RNA

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

CuAAC
▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶2´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶3´-O-プロパルギル(rA,rG,rC,rU)修飾オリゴDNA・RNA
▶C8アルキン(オクタジニル)(dA,dC,dT)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニル(dA,dU)修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 
SPAAC
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA

各種ラインナップについて、様々なリンカータイプを取り揃えております。リンカーを明記した詳しい構造をホームページにアップしておりますので、ご参考ください。また、ご希望のリンカーがない場合でも、使用する試薬を変更したり、スペーサー修飾等を用いてカスタムすることで解決できる場合もあります。是非一度、ご相談ください。

生命活動を支える塩基修飾
RNA修飾塩基【シュードウリジン編】

シュードウリジンは、ほとんどのRNAに見いだされる修飾塩基です。シュードウリジンには、いくつかの役割があると考えられていますが、依然としてよく理解されていない修飾であるという認識は、未だ顕在のようです。

▶今回ご紹介する文献では、E.coliのチロシンtRNAのアンチコドン中のシュードウリジン検出を網羅的に行うことで、シュードウリジンがmRNAとtRNAとの間のコドン-アンチコドン相互作用を調節する働きを持つことを見出し、治療に一役を担う可能性を示唆しています。

シュードウリジンへの改変が存在しないと、mRNAからの翻訳能力が損なわれてしまうため、チロシンコドンが豊富なmRNAではその翻訳に影響が生じてしまいます。また逆にmRNAのシュードウリジンの改変によって、免疫原性を制御し、安定的に翻訳を進めることができるであろうと報告しています。

asubrahmanyam, and Patrick A. Limbach. “Pseudouridine in the Anticodon of Escherichia coli tRNATyr (QΨA) Is Catalyzed by the Dual Specificity Enzyme RluF.” Journal of Biological Chemistry 291.42 (2016): 22327-22337.

日本遺伝子研究所では、配列中に『核酸塩基』を挿入したオリゴDNA・RNAの合成を承ります。

▶イノシン(inosine) ▶5-メチルシトシン(5-me-C) ▶5-メチルウリジン(5-me-U)(T)

▶N6-メチルアデノシン (N6-me-A)  ▶1-メチルアデノシン(1-me-A)

▶シュードウリジン(Pseudouridine) ▶1-メチルシュードウリジン(1-me-Pseudouridine)

▶5-ブロモウリジン(5-Br-U) ▶5-ヨードウリジン(5-I-U) 

▶6-チオグアノシン(6-thio-G) ▶4-チオウリジン(6-thio-U)

▶2-アミノプリン(2-Aminopurine)

▶2,6-ジアミノプリン(2,6-Diaminopurine)(2-amino-A)

…他、ご相談も承ります。

 

生命活動を支える塩基修飾
核酸の修飾塩基【N6-メチルアデノシン】

RNAの修飾塩基にはたくさんの種類がありますが、今回は、N6-メチルアデノシンに焦点を当ててご紹介したいと思います。

遺伝情報の発現は様々なレベルで調節されていますが、その中でも転写後における遺伝子発現制御には、明確な利点があると言われています。翻訳自体に影響を与えることがないということは、注目すべきことです。N6-メチルアデノシンは、mRNA中でも特に豊富に見受けられる転写後修飾です。今回ご紹介する文献では、転写後レベルにおけるその役割について述べられています。

m6A(N6-メチルアデノシン)修飾オリゴヌクレオチドをmRNA断片として用いて比較し、m6Aの役割やその効果について調べた文献です。mRNAのm6A修飾によって、翻訳や伸長そのものへは影響を与えず、その動的な挙動に変化や調節をもたらすことができる可能性を示唆しています。

Choi, Junhong, et al. “N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation elongation dynamics.” Nature structural & molecular biology 23.2 (2016): 110.

日本遺伝子研究所では、配列中に『核酸塩基』を挿入したオリゴDNA・RNAの合成を承ります。

▶イノシン(inosine) ▶5-メチルシトシン(5-me-C) ▶5-メチルウリジン(5-me-U)(T)

▶N6-メチルアデノシン (N6-me-A)  ▶1-メチルアデノシン(1-me-A)

▶シュードウリジン(Pseudouridine) ▶1-メチルシュードウリジン(1-me-Pseudouridine)

▶5-ブロモウリジン(5-Br-U) ▶5-ヨードウリジン(5-I-U) 

▶6-チオグアノシン(6-thio-G) ▶4-チオウリジン(6-thio-U)

▶2-アミノプリン(2-Aminopurine)

▶2,6-ジアミノプリン(2,6-Diaminopurine)(2-amino-A)

…他、ご相談も承ります。

 

RNA保存液「RNA SHIELDERTM

ssRNAやtotalRNAを、冷蔵(2~8℃)で溶液のまま、安定的に長期保存するための保存液、RNA SHIELDERTM。今回も引き続き、よくいただくご質問をご紹介したいと思います。

第2回めとなる今回は、『実際にRNA SHIELDERTMを使用する際の諸注意』に関してご紹介します。

FAQ1
Q.RNA SHIELDERTMの具体的な使用方法を教えてください。
A.RNA SHIELDERTMは10×試薬です。RNAサンプル:RNA SHIELDERTM=9:1の体積混合比となるように混和してください。冷蔵(2~8℃)で、溶液のままで保存できます。(混合例…RNAサンプル 45µL に対して、RNA SHIELDERTM 5µL)また、RNAサンプル保存の場合、RNA SHIELDERTM混合後の推奨濃度は10ng/µL~2µg/µLです。この範囲から外れる場合には、希釈や濃縮を行っていただくことをお奨めいたします。

FAQ2
Q.保存したいRNAの溶媒は、何であっても大丈夫でしょうか。RNA保存能は、溶媒によって差が出ることはありますか。
A.TE buffer、DEPC Water、RNase Free Waterで、保存能に差が出ないことが確認されています。

FAQ3
Q.RNA SHIELDERTMと混合したssRNAのコピー数の算出方法を教えてください。
A.弊社では、RNA塩基の平均分子量を用いた以下の式で算出しております。この際にご注意いただきたいのが、吸光度測定はRNA SHIELDERTM混和する前に行っていただきたいという点です。

ssRNA質量濃度: Cm ng/µL
ssRNA鎖長: N
RNA塩基の平均分子量: 340 Da
アボガドロ数: 6.02×1023 copy/mol
Cm [ng/µL]=Cm×10-9 [g/µL] =(Cm×10-9)÷(340×N) [mol/µL]
=(Cm×10-9×6.02×1023)÷(340×N) [copy/µL]

FAQ4
Q.RNA SHIELDERTMと混合したtotalRNAの質量はどのようにして求めれば良い?
A.吸光度から算出します。弊社のホームページにある便利ツールで簡単に算出できますので、是非ご活用ください。この際、吸光度測定はRNA SHIELDERTM混和する前に行ってください。

その他にもご質問等がありましたら、弊社まで直接お問い合わせください。

RNA保存液「RNA SHIELDERTM

ssRNAやtotalRNAを、冷蔵(2~8℃)で溶液のまま、安定的に長期保存するための保存液。それが、RNA SHIELDERTMです。これまで、RNA SHIELDERTMに関するご質問をたくさんいただきました。もっと本製品を知っていただくために、特に多かったご質問を、2回に分けてご紹介したいと思います。

第1回めは、『RNA SHIELDERTMの特長』に関するご質問に絞ってご紹介します。

FAQ1
Q.RNA SHIELDERTMの類似品がたくさんあるように思うのですが。
A.他製品との違いは、RNA自体を冷蔵(2~8℃)で溶液のまま長期保存できること。組織や細胞を保存する試薬ではないという点が大きく異なります。コントロールRNAの溶液保存や、RNA抽出に起因するバラツキを解消したい方にお薦めです。溶液保存なので凍結融解によるRNA劣化の心配がありません。

FAQ2
Q.RNA SHIELDERTMを使用した時のRNAサンプルの保存条件と保存期間を教えてください。
A.RNAを、冷蔵(2~8℃)で溶液のまま保存できます。正しい混合比率(体積混合比 RNAサンプル:RNA SHIELDER=9:1)の場合、totalRNAで1年、ssRNAで半年間保存できることが確認されています。

FAQ3
Q.RNA SHIELDERTMの試薬としての使用期限は?
A.-20℃凍結保存で未開封の場合、使用期限は1年です。

FAQ4
Q.使いかけのRNA SHIELDERTMの保管方法は?
A.未開封時は-20℃凍結保存を推奨しております。開封後は2~8℃冷蔵保存いただき、できるだけ早めにご使用ください。-20℃での再凍結も可能ですが、融解を繰り返しは避けていただくようにしてください。

FAQ5
Q.RNA SHIELDERTMによる反応系への阻害が心配です。
A.心配はありません。弊社ではRNA SHIELDERTMの開発とともに、RNA SHIELDERTMで4℃保存したサンプルRNAを用いて、実験系への有効性を検証しています。逆転写反応およびPCRを阻害しないというだけでなく、次世代シーケンスにおいても-80℃保存のサンプルと同等の結果が得られています。

詳しくは、弊社ホームページの「NGS実験系データ」「保存試験データ」をご覧ください。

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

引き続き、銅(I)イオンを触媒としたアジドとアルキンの付加環化反応(CuAAC)のアプリケーション例をご紹介します。今回は、オリゴヌクレオチドを用いて目的とする構造体を構築したという文献と、オリゴヌクレオチドを用いたナノ構造体について幅広く概説したレビューの二つをご紹介したいと思います。

CuAACアプリケーション例:DNAナノチューブを用いてカテナン構造体を構築

▶▶まず、28mer、41merのオリゴヌクレオチドをタイル状に組み合わせてDNAナノチューブをつくります。この際に、隣接したストランドを、アルキンとアジドで両端を修飾したオリゴヌクレオチド二本で置き換えます。これらのオリゴヌクレオチドは一部が重なり合うようにデザインされているので、クリック反応、denature(熱変性)することによって、カテナン構造体が得られた、という文献です。クリック反応に関わる試薬や条件によるDNAナノチューブやカテナン構造体の安定性への悪影響がなかったこと、従来方法におけるDNA構造の安定性の問題を解決する結果が得られたことも併せて述べられています。このような構造体の生成はカテナンだけに限定されず、オリゴヌクレオチドを組み立てていくことで様々な応用の可能性が考えられるそうです。将来、多岐にわたるアプローチへの道を開くものとなるだろうと報告しています。

Cassinelli, Valentina, et al. “One‐Step Formation of “Chain‐Armor”‐Stabilized DNA Nanostructures.” Angewandte Chemie International Edition 54.27 (2015): 7795-7798.

CuAACアプリケーション例:オリゴヌクレオチドを用いたナノ構造体

▶▶化学的性質、サイズ、形状などをより正確にプログラム制御できる『DNAナノ構造』『DNAナノマシン』の応用例として、バイオアプリケーションに焦点を当てたレビューです。DNAナノ構造が細胞に取り込まれどのような運命をたどるのか。物理化学的および生物学的見地から理解を深めていくことで、将来のDNAナノテクノロジーの可能性をさらに広げるだろうと解説しています。

Lee, Di Sheng, et al. “Cellular processing and destinies of artificial DNA nanostructures.” Chemical Society Reviews 45.15 (2016): 4199-4225.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

銅(I)イオンを触媒としたアジドとアルキンの付加環化反応(CuAAC)のアプリケーション例をご紹介したいと思います。

CuAACアプリケーション例:次世代シーケンシングにおけるアダプター結合

次世代シーケンシングの際に行うクローン増幅では、ライブラリー断片は固相表面上で増幅されます。今回は、ライブラリーアダプターと固相表面の結合リンカーについて発表した文献をご紹介します。

▶▶エマルジョンPCR(emPCR)によるクローン増幅における、官能化されたビーズ表面と標識オリゴヌクレオチドの化学的戦略に関する文献です。ビオチン-ストレプトアビジン結合、アミノ-カルボン酸のアミド結合、アジド-アルキン付加環化(CuAAC)、マレイミドのマイケル付加を比較検証しています。十分量のオリゴヌクレオチドを効率的に固定化できること、Taqポリメラーゼのはたらきを阻害しないことを条件に、pHや塩濃度、結合反応がシンプルであることなども加味すると、CuAACまたはマイケル付加が有効に機能できる結合方法であることが述べられています。さらにコストなどの厳しい条件を追加すると、CuAACが特に有用であると結論付けられています。

Malone, Marie L., Valerie J. Cavett, and Brian M. Paegel. “Chemoselective Coupling Preserves the Substrate Integrity of Surface-Immobilized Oligonucleotides for Emulsion PCR-Based Gene Library Construction.” ACS Combinatorial Science 19.1 (2016): 9-14.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA

重要な役割を担う、脱メチル化誘導体
「エピジェネティック修飾オリゴDNA」

今回は、エピジェネティックな制御による化学変換機構を利用した『DNAをベースとしたデジタルデータの保存』に関する文献をご紹介したいと思います。DNAの可能性をさらに拡大させる興味深い文献です。

▶▶エピジェネティックな情報の生物学的調節に着想を得、デジタル情報を保存するための媒体として、DNAに着目しています。単一のDNA鋳型に複数の情報層をどのように保存できるかを実証しており、さらにDNAにコード化された情報層の変換や復元をも実現しています。バイサルファイト処理によるCからUへの変換(A・Tはその処理の影響を受けない)、脱メチル化による5hmCから5fCまたは5caCへの酸化変換や、それとは逆に5fCを5hmCに戻す還元反応など、可逆的な情報の相互変換を行うことで、複数のデータを1つのライブラリーに保存することが可能となったことを報告しています。

Mayer, Clemens, et al. “An Epigenetics‐Inspired DNA‐Based Data Storage System.” Angewandte Chemie International Edition 55.37 (2016): 11144-11148.

メチル化シトシンと、水酸化酵素によって変換される脱メチル化誘導体を挿入したオリゴDNAの合成を承ります。1本のオリゴDNA配列中に、以下の4種を共存挿入できます。1種の挿入から合成可能です。

5-メチル化シトシン (5-me-dC)
5-ヒドロキシメチル化シトシン (5-hm-dC)
5-ホルミル化シトシン (5-f-dC)
5-カルボキシル化シトシン (5-ca-dC)

 

生命活動を支える塩基修飾
RNA修飾塩基「シュードウリジン編」

核酸塩基。どれほどの種類があるのか、ご存知ですか?

アデニン・グアニン・シトシン・チミン・ウラシル。誰もが知るこれら以外にも、修飾を受けた核酸塩基が、実は100以上もあると言われています。中でも特に有名な修飾方法は、メチル化。それから、シュードウリジン化。さらに、脱アミノ化、チオ化など…。中にはそのはたらきの解明が十分になされていないものもあります。

今回は、この中からシュードウリジン化に焦点を当てます。シュードウリジン(Pseudouridine、5-ribosyluracil、Ψ)は、転写後RNA修飾によって生成される唯一の「修飾を受けても質量が変化しない」ヌクレオシドです。質量がウリジンと同じであることからその質量分析は難しく、従来方法では多くの制限があります。

▶RNA中のシュードウリジンを定量分析するための方法を記載した文献をご紹介します。衝突誘起解離(Collision-induced dissociation:CID)質量分析を行い、構造情報を持ったスペクトルを得る方法です。本文献では、既知配列のシュードウリジン含有・非含有の短鎖合成RNAを用いて比較することで、この方法の評価を行っています。

Yamauchi, Yoshio, et al. “A mass spectrometry-based method for direct determination of pseudouridine in RNA.” Nucleic acids research 44.6 (2016): e59-e59.

日本遺伝子研究所では、配列中に『RNA修飾塩基』を挿入したRNAの合成を承ります。
▶イノシン(inosine) ▶5-メチルシトシン(5-me-C) 
▶N6-メチルアデノシン (N6-me-A)  ▶1-メチルアデノシン(1-me-A)
▶シュードウリジン(Pseudouridine) 
▶1-メチルシュードウリジン(1-me-Pseudouridine)
▶5-ブロモウリジン(Br-U) ▶5-ヨードウリジン(5-I-U) 
▶6-チオグアノシン(6-thio-G) ▶2-アミノプリン(2-Aminopurine) 

…他、ご相談に応じます。

 付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

銅(I)イオンを触媒としたアジドとアルキンの付加環化反応(CuAAC)のアプリケーション例をご紹介したいと思います。

CuAACアプリケーション例:合成DNA-ペプチドヘテロコンジュゲート作製

ヘテロコンジュゲートを作製する際の手段は、昨今ではUV架橋が広く用いられています。しかし複雑な混合物であればあるほど、その中に含有する架橋されたコンジュゲートの質量分析同定や、架橋の特異的部位のMS/MS測定は困難を極めます。今回はこの課題を克服するための方法を報告した文献をご紹介します。

▶▶合成DNA-ペプチドヘテロコンジュゲートは、質量分析による試料調製、イオン化、断片化、検出のためのツールとして用いられます。本文献では、前述した課題を克服するために、CuAAC技術を用いています。アジド修飾ペプチドとアルキン修飾DNAオリゴヌクレオチドによって構築された合成DNA-ペプチドヘテロコンジュゲートは、DNAとペプチドがトリアゾール環を介する構造をとります。

Flett, Fiona J., et al. “Click Chemistry Generated Model DNA–Peptide Heteroconjugates as Tools for Mass Spectrometry.” Analytical chemistry 87.19 (2015): 9595-9599.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA・RNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

クリックケミストリーHuisgen反応は、その反応機構を用いた様々な応用が期待されています。今回は銅(I)イオンを触媒としたアジドとアルキンの付加環化反応(CuAAC)のアプリケーション例をご紹介したいと思います。

CuAACアプリケーション例:FISH用DNAプローブの標識

FISH(蛍光in situハイブリダイゼーション)に用いるDNAプローブの標識には、ニックトランスレーション法・ランダムプライムドラベリング法・PCRラベリング法・エンドラベリングやテーリング等、様々な方法が用いられてきました。特に広く利用されている方法ニックトランスレーション(NT)ですが、鎖長の長い二本鎖DNAでは有用性を発揮するものの、オリゴヌクレオチドのような短い一本鎖DNAの標識には向いていないと言われています。今回ご紹介する文献では、この問題点を解決するための試みを提案しています。

▶▶ニックトランスレーション(NT)に替わるFISH用プローブの標識方法として、銅イオンを触媒とするアジドとアルキンの付加環化反応(CuAAC)を紹介しています。CuAACによって標識したプローブのハイブリダイゼーション効率を従来の標識技術によって得られたものと比較し、非常に有望視しています。さらに、このようなプローブを免疫組織化学(IHC)などの他の技術にも実現できる可能性を示唆しています。

Hesse, Susann, et al. “Fluorescent labelling of in situ hybridisation probes through the copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition reaction.” Chromosome Research 24.3 (2016): 299-307.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA・RNA

▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA・RNA

▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA・RNA

▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA・RNA 

▶エチニルdU修飾オリゴDNA・RNA

▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA・RNA 

 

重要な役割を担う、脱メチル化誘導体
「エピジェネティック修飾オリゴDNA」

異常なDNAメチル化は、ヒトに様々な疾患をもたらすと言われています。今回は、エピジェネティックな遺伝子発現調節に関与するMeCP2をはじめとするMBD(methyl binding domain)について述べた文献をご紹介します。例えばレット症候群。原因の90%以上がMeCP2の遺伝子変異であると言われています。

▶▶5-メチルシトシン結合剤(MBD)や修飾剤(TET)の相互作用について、これまでは十分な研究がなされていませんでした。DNAへのMBDの結合は、メチル化CpGの転写抑制に働き、TETが媒介する脱メチル化において5-me-dCを保護すると考えられています。このメカニズムについて、TET のDNAへのアクセスを制限しているのは、メチル化CpGと結合したMBDではなく、MBDそのものであると記述しています。本文献では、5-hm-dCの定量を行うために、5-me-dCを挿入したオリゴDNAを用いています。

Binding of MBD proteins to DNA blocks Tet1 function thereby modulating transcriptional noise, Nucleic Acids Res (2017) 45 (5): 2438-2457.

メチル化シトシンと、水酸化酵素によって変換される脱メチル化誘導体を挿入したオリゴDNAの合成を承ります。1本のオリゴDNA配列中に、以下の4種を共存挿入できます。1種の挿入から合成可能です。

5-メチル化シトシン (5-me-dC)
5-ヒドロキシメチル化シトシン (5-hm-dC)
5-ホルミル化シトシン (5-f-dC)
5-カルボキシル化シトシン (5-ca-dC)

重要な役割を担う、脱メチル化誘導体
「エピジェネティック修飾オリゴDNA」

DNA脱メチル化に関連する文献をご紹介したいと思います。

TETは、DNA中の5-メチルシトシン(5-mC)を5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)、5-ホルミルシトシンおよび5-カルボキシルシトシンに順次変換し、DNA脱メチル化をもたらす酵素です。急性骨髄性白血病(AML)などの骨髄性悪性疾患をはじめとする癌においてTET変異が確認されており、5-hmCレベルはTETの動態や特性を示すものと考えられています。

▶▶今回ご紹介する文献では、TET阻害剤としてのフマル酸塩やコハク酸塩、それによって調節される5-hmCやHIF(低酸素誘導因子) 標的遺伝子について記述されており、遺伝子発現のエピジェネティックな調節が多層的に行われていることが示唆されています。本文献では、TET酵素活性を測定するために、メチル化シトシン (5-me-dC)を含むオリゴヌクレオチドを使用しています。

Fumarate and Succinate Regulate Expression of Hypoxia-inducible Genes via TET Enzymes, The Journal of Biological Chemistry, 291, 4256-4265, February 19, 2016

メチル化シトシンと、水酸化酵素によって変換される脱メチル化誘導体を挿入したオリゴDNAの合成を承ります。1本のオリゴDNA配列中に、以下の4種を共存挿入できます。1種の挿入から合成可能です。

5-メチル化シトシン (5-me-dC)
5-ヒドロキシメチル化シトシン (5-hm-dC)
5-ホルミル化シトシン (5-f-dC)
5-カルボキシル化シトシン (5-ca-dC)

 

重要な役割を担う、脱メチル化誘導体
「エピジェネティック修飾オリゴDNA」

DNAのメチル化は、重要なエピジェネティックな役割を担うと言われています。そしてDNA脱メチル化の分子メカニズムには、まだまだ議論の余地が残っていると考えられています。必要のない遺伝情報を隠すためのメチル化と、必要になった時にその情報を復元させる脱メチル化。理に適ったこのシステムに対して、様々な提唱がなされています。

▶▶ 5-me-dC, 5-hm-dC, 5-ca-dCを挿入したオリゴDNAを用いて、DNA脱メチル化の機構の解明を試みている文献をご紹介します。

DNA脱メチル化は、5-メチル化シトシン (5-me-dC)が5-ヒドロキシメチル化シトシン(5-hm-dC)、5-ホルミル化シトシン(5-f-dC)および5-カルボキシル化シトシン(5-ca-dC)へと酸化されることで進行します。これらはすべてDNA脱メチル化の中間体として関与しており、この脱メチル化の機構は高度に管理された複雑なものであると考えられています。この文献では、TET(ten–eleven translocation)タンパクとTDG(チミンDNAグリコシラーゼ)による塩基除去修復(BER)、特に能動的な脱メチル化のメカニズムに着目しています。

Biochemical reconstitution of TET1–TDG–BER-dependent active DNA demethylation reveals a highly coordinated mechanism, Nature Communications 7, Article number: 10806 (2016), doi:10.1038/ncomms10806

メチル化シトシンと、水酸化酵素によって変換される脱メチル化誘導体を挿入したオリゴDNAの合成を承ります。1本のオリゴDNA配列中に、以下の4種を共存挿入できます。1種の挿入から合成可能です。

5-メチル化シトシン (5-me-dC)
5-ヒドロキシメチル化シトシン (5-hm-dC)
5-ホルミル化シトシン (5-f-dC)
5-カルボキシル化シトシン (5-ca-dC)

小さなRNAが未来を切り拓く

マイクロRNA(miRNA)はRISC(RNA-induced silencing complex) と呼ばれるタンパク質との複合体の重要な構成要素です。この複合体はRNAと相補的な配列領域を持つ遺伝子の発現を調節する機能を発揮します。miRNA自身は反応を触媒することはなく、複合体を形成することで作用します。

▶▶このRISCからmiRNAを取り去ることによってRISCの機能を阻害することも出来ます。今回ご紹介する文献では標的遺伝子と相補的な配列を持つAMO(anti-miRNA oligonucleotide)を用いてRISCからmiRNAを放出させるプロファイリングについて解析しています。AMOの種類としてはRISCによる塩基配列の切断に対して耐性のない野生型AMOが耐性のあるOMe修飾のAMOに比べて高い放出効率を示しました。また超短鎖AMO(LNA)では放出は起きず、RISC活性を阻害しないことも報告しています。

Characterization of the releasing profile of microRNA from RISC using anti-miRNA oligonucleotides, Chemistry Letters, Jan 2017, Vol.46, No.1, 143-145

日本遺伝子研究所では、miRNAの合成を承ります。

他にも、3´末端に2塩基のDNAオーバーハング(dTdT)をもつ二本鎖siRNA、各種修飾RNA等の合成も受け付けておりますので、ご相談ください。

qPCR法の新たな技術がここに誕生!
「Hypercoolテクノロジー™」

ノロウイルス GII.P17-GII.17型のように、相同性配列やExon境界の位置・二次構造形成の影響などから、従来のアンプリコンサイズのデザインが困難なケースがあります。また、FFPE病理組織、血漿・血清中、尿中の核酸は、分解が進んでいるものが多く、100nt以下まで分解しているものも少なくありません。

このような場合に、プライマーやプローブのTm値上昇させ、短いアンプリコンサイズにおける短いプライマー・プローブのデザインを可能とした技術が、Hypercool™テクノロジーです。

多数導入、連続投入の実現 ⇒ Tm値上昇ヌクレオチドの導入合成法を確立
複雑で困難な配列のTm値算出が実現 ⇒ Tm値算出法を確立

 

Hypercool™テクノロジーと従来法とのPCR定量値の比較

日本遺伝子研究所は、感度および信頼性を向上させるHypercool™テクノロジーによって、皆さまの研究をサポートいたします。

 

小さなRNAが未来を切り拓く

 

マイクロRNA(miRNA)は、複数の遺伝子を標的として機能するNon-coding RNAです。癌、糖尿病および心臓血管疾患などにおけるmiRNAの役割は言うまでもありませんが、最近の研究において、特に内皮細胞(EC)の機能調節を介し、血管新生を調節するmiRNAの重要な役割が明らかにされたことが報告されています。

▶▶今回ご紹介する文献では、血管新生を調節するため、ポリマーで官能化したカーボンナノチューブ(CNT)を用いた内皮細胞(EC)へのmiRNA送達という新しい戦略を報告しています。ここでは血管形成調節因子としてmiR-503オリゴヌクレオチドを用いており、その取り込みの動態を調べるため、オリゴヌクレオチドをCy3標識しています。CNTをポリマーで覆うことで毒性を低下させ、さらにmiR-503オリゴヌクレオチドの安定化、ECへの効率的な送達を可能にしたと記述されています。

Regulation of angiogenesis through the efficient delivery of microRNAs into endothelial cells using polyamine-coated carbon nanotubes, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, August 2016Volume 12, Issue 6, Pages 1511–1522

日本遺伝子研究所では、miRNAの合成を承ります。また文献中にも登場した、Cy3修飾も承っております。他にも、3´末端に2塩基のDNAオーバーハング(dTdT)をもつ二本鎖siRNA、各種修飾RNA等の合成も受け付けておりますので、ご相談ください。

 

小さなRNAが未来を切り拓く

miRNAは、遺伝子の重要な調節因子であると考えられています。miRNA inhibitor(阻害剤)はターゲットとなるmiRNAの機能を阻害します。このようなinhibitorとして機能する核酸(AMO:anti-miRNA oligonucleotide)は、現在では様々な種類が開発されており、その重要性はますます注目されています。

▶▶ 今回ご紹介する文献も、AMOについて記載されたものです。miRNAの機能的役割を、合成miRNAを用いて調べています。miRNAの機能を阻害するために用いられる合成miRNA inhibitor(2′-O-メチル修飾miRNA)の標的部位におけるミスマッチの影響を評価し、その機能や効果の系統的な実験を報告しています。一つのmiRNAに対して設計されたinhibitorが、他のmiRNAに対してどれほど影響を与えるのか。合成miRNA inhibitorが、より少量で効率的にデリバリーされ得るのか。本文献では、合成miRNAがinhibitorとして、大変有効に働くことが記述されています。

Specificity and functionality of microRNA inhibitors, Silence. 2010; 1: 10.

日本遺伝子研究所では、miRNAの合成を承ります。また文献中にも登場した、2′-Oメチル(2’-OMe)修飾も承っております。

他にも、3´末端に2塩基のDNAオーバーハング(dTdT)をもつ二本鎖siRNA、各種修飾RNA等の合成も受け付けておりますので、ご相談ください。

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

今回も引き続き、銅イオンフリー付加環化反応のための『BCN(ビシクロノニン)』を用いた応用例をご紹介します。

▶▶ペプチドとオリゴヌクレオチドがそれぞれに自律的に構造を形成して複合的に関与するような『ペプチド-オリゴヌクレオチド結合体』を構築したという文献です。3種類の5´BCN修飾オリゴDNAに対して、N末端にアジド修飾したペプチドをHuisgen反応させ、これらをハイブリさせます。すると、オリゴヌクレオチド部分は三重鎖となり、またペプチド部分はコイルドコイル構造をとります。従来の化学合成に替わってHuisgen反応を用いたことで、効率的かつ高収量で実施することができ、ミリグラム規模の生成が実現したと述べられています。

Peptide–oligonucleotide conjugates as nanoscale building blocks for assembly of an artificial three-helix protein mimic, Nature Communications 7, Article number: 12294 (2016)

BCNは、安定して単離可能な最小の環状アルキンC8H12にシクロプロパンを融合させた歪んだアルキンです。小分子嵩、反応性、選択性、簡便性、対称構造 (位置異性体が単一)などが、そのメリットとして挙げられます。

日本遺伝子研究所では、BCN(ビシクロノニン)修飾の他にも、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶ジベンゾシクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA 


qPCR法は、高感度で特異的な反応であることに加え、結果が迅速に得られるという利点があります。低コピー数のウイルスDNAでも検出することができます。検体によっては、潜伏感染状態であっても検出されてしまうことも考慮し、定量的な測定法による評価をすることが重要であると言われています。

日本遺伝子研究所では、qPCR用のCMV・EBVプライマープローブセット(検量線スタンダード付き)をご提供しております。お求めの際は、日本ジェネティクス株式会社へ製品№を添えて、ご注文ください。

qPCR用CMV PPS セット(製品No. 6383530)
qPCR用EBV PPS セット(製品No. 6383521)

■LightCycler®480(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)、Applied BiosystemsリアルタイムPCR機器に対応しています。
■検量線スタンダード付き。
■最適化反応確認を行い、反応プロトコルを添付しています。
■CMVとEBVのDNA定量は、同一PCRプログラムにおける同時RUNが可能です。
CMVのDNA定量に用いられる「major immediate-early protein, IE領域」には二つの変異のタイプ
があり、弊社のqPCR用プローブは、これに対応した二種のプローブを含んだもの
となっています。
EBVのDNA定量には、BALF5遺伝子領域に対応したqPCR用プローブを採用しております。

*弊社は本セットに関する製造・販売ライセンスをF. Hoffmann-La Roche Ltd.より受けています。
*2016年10月受注分より「CMV PPS セット」「EBV PPS セット」の販売元が、日本ジェネティクス株式会社に変更となりました。

 

ダブルラベルプローブとHypercool テクノロジー™

▶▶短鎖プローブとHypercoolテクノロジー™

Hypercoolテクノロジー™を導入したダブルラベルプローブでは、その鎖長を短くデザインすることが可能となりますので、ジェノタイピングアッセイなどに有用です。弊社のダブルラベルプローブの豊富なラインナップと、Tm値の観点からプローブ長をコントロールできる技術で、思いに適った配列をデザインしてみませんか。

▶▶Hypercoolテクノロジー™とは?

『Tm値上昇ヌクレオチド』を用いてTm値を調節し、目的とする温度まで上昇させる、これがHypercool テクノロジー™です。

プライマー・プローブ配列中のアデニンdAを「2-amino-dA」に置換、もしくはシトシンdCを「5-Methy-dC」に置換すると、Tm値を1塩基あたり1~2℃上昇させることができます。この技術によって、鎖長の短いプライマー・プローブをPCR条件内にデザインすることが容易になります。

 

ロングオリゴDNA(~150merまで)

日本遺伝子研究所では、独自の「脱プリン化オリゴ除去処理」を施したロングオリゴDNAをお届けしています。このポリカチオンdetergent処理により脱プリン化オリゴを除去する手法によって、他にない高品質なロングオリゴDNAの製造が実現しています。

▶脱プリン化オリゴとは
鎖長が長くなるほど、強酸性試薬にさらされる機会が増加するオリゴDNA合成。強酸性試薬は、プリン塩基(アデニン・グアニン)を脱プリン化してしまう危険性を持っています。脱プリン化された部分は、熱などの負荷によって簡単に切断されてしまいます。このような脱プリン化塩基を含むオリゴDNA鎖の除去処理をすることが、ロングオリゴDNAを製造するにあたり大切なことの一つであると認識しています。

▶『リアルタイムPCRにおける脱プリン化オリゴの影響』のデータを弊社ホームページに掲載しています。

▶ロングオリゴDNAの用途は様々。SNPの導入やタグ配列挿入のような短鎖長の取り込みを目的とする場合や、コントロールとしてご使用いただく場合など、どんな用途にでも適用できる品質であることを自負しています。弊社では、150merまでのロングオリゴDNA合成を承っております。

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

銅イオンフリー付加環化反応のための歪んだアルキンである『BCN(ビシクロノニン)』。今回は、その有用性に焦点を当てます。生体分子のバイオ直交型標識では、細胞機能を損なうことなく生体分子を標識化するために、銅イオンフリーであることは必須です。BCN(ビシクロノニン)には、分子嵩が小さいこと、高い反応性、非常に簡単な反応であること、構造が対称であること(位置異性体が単一)などの利点があります。

▶▶今回ご紹介する文献では、生命科学や材料科学や表面改質及び分子診断などの分野において、BCNが大きなメリットを持っていることが述べられています。金属イオンを用いず、効率的な分子の結合を必要とするアプリケーションで、広い範囲における応用が期待できると記載されています。

Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 9422 –9425

日本遺伝子研究所では、BCN(ビシクロノニン)修飾の他にも、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA
NEW!
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA
▶エチニルdU修飾オリゴDNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA 

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

これまで、『銅イオンを触媒としたアルキンとアジドの反応で連結させた一本鎖DNAは、PCR増幅される』こと、『銅イオンフリー付加環化反応(DBCOやBCNとアジド)でクリックライゲーションできる』ことをご紹介してきました。今回はこれまでのご紹介の経緯から、『銅イオンフリー(BCNとアジド)クリックライゲーションさせた一本鎖DNAが、PCRリードスル―する』ことを報告した文献をご紹介します。

クリック反応によって生成されるトリアゾール結合がDNAホスホジエステル結合に擬似することを利用して、PCRリードスル―させた文献は少なくありません。しかし銅イオンフリーで行う場合、結合部分の分子嵩が小さいことがリードスル―の必要条件となる、つまり歪んだアルキンの分子嵩が重要になるようです。

▶▶ BCNを用いた銅イオンフリークリックライゲーションを行い、RT-PCRによってリードスル―されたことを、本文献では紹介しています。またBCNクリックライゲーションをはじめとした、『オリゴヌクレオチドの化学的ライゲーションからPCR増幅まで』の様々なアプローチが、Table1にまとめられています。

Chemical ligation methods for the tagging of DNA-encoded chemical libraries, Chemical Biology 2015, 26:80–88

▶▶オリゴヌクレオチドの化学的なライゲーションからPCRリードスル―の様々な方法を紹介した文献です。CuAAC(銅イオン触媒アルキン-アジド付加環化)やSPAAC(銅イオンフリー付加環化)、チミジン-ソラーレン付加環化などが挙げられており、最適な方法を目的に合わせて検討する際に、ご参考いただければ幸いです。

Universal strategies for the DNA-encoding of libraries of small molecules using the chemical ligation of oligonucleotide tags, Artificial DNA: PNA & XNA 5, e27896; January 2014

 

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA
NEW!
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA 

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

▶▶今回紹介する文献では、銅イオンフリーのもとでDNAを連結させるため、シクロオクチン(DBCO)だけではなく、ビシクロノニン(BCN)という同じく歪んだアルキンも用いています。ビシクロノニン(BCN)はシクロオクチン(DBCO)に比べて分子嵩が小さいことが特長です。

Solid phase click ligation for the synthesis of very long oligonucleotides, Chem. Commun., 2013, 49, 6959

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。また、文献にてご紹介しました、銅イオンフリー用『ビシクロノニン修飾オリゴDNA』の合成も承ります。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA
NEW!
▶ビシクロノニン(BCN:bicyclo[6.1.0]nonyne)修飾オリゴDNA 
▶エチニルdU修飾オリゴDNA
▶エチニルdSpacer修飾オリゴDNA

 

組み合わせのパターン・品質の高さはトップレベル!
「ダブルラベルプローブ」

▶▶日本遺伝子研究所のダブルラベルプローブで、デジタルPCRを。

「次世代のPCR技術」とも言われるデジタルPCR。バンドの濃さによって濃度を推測するPCR、既知の標準サンプルから検量線によって濃度を求めるリアルタイムPCRに次いで登場した「核酸の絶対定量を可能とするデジタルPCR」は、いま、急激にその注目度を上げています。

これまでの合成経験と、ご要望に細やかに対応できる力を併せ、充実したダブルラベルプローブのラインナップ表をつくり上げました。もちろん、ラインナップ表に記載のない組合せも、ご相談に応じます。
リアルタイムPCRだけでなく、デジタルPCRにも、自信をもってお薦めします!

▶デジタルPCRではこんなことができる。

デジタルPCRに関連する論文数は、増加傾向にあるようです。参考までに、その中からほんの数例ですがご紹介したいと思います。FAM&BHQ1プローブとHEX&BHQ1プローブを使用した例を集めてみました。

ゲノム編集における変異導入効率を評価するためにGEF-dPCR (Digital PCR to assess gene-editing frequencies)を用い、遺伝子ノックアウト率の定量化を行なっています。

Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases, nature protocols, VOL.11 NO.3, 2016, 598-615

メタノール資化酵母 Pichia pastorisを用いた組み換えタンパク質生産において、最適な遺伝子量を決定するために、ddPCR(Droplet Digital PCR)を利用した論文です。

Droplet Digital PCR-Aided Screening and Characterization of Pichia pastoris Multiple Gene Copy Strains, Biotechnol Bioeng, 2016 Jul;113(7):1542-51

遺伝子治療や遺伝子工学のための有望なツールであるアデノウイルスベクター。小スケールでベクターを調製しその品質管理を行うために、ddPCR(Droplet Digital PCR)を利用しています。

Standard Free Droplet Digital Polymerase Chain Reaction as a New Tool for the Quality Control of High-Capacity Adenoviral Vectors in Small-Scale Preparations, HUMAN GENE THERAPY METHODS 26:25–34 (February 2015)

 

組み合わせのパターン、品質の高さはトップレベル!
「ダブルラベルプローブ」

▶▶日本遺伝子研究所のダブルラベルプローブ

ダブルラベルプローブは、リアルタイムPCRやデジタルPCRに用いるための加水分解プローブです。オリゴヌクレオチドの5´と3´を蛍光色素とクエンチャーで修飾します。用途に合わせて、蛍光色素やクエンチャーを選択できます。

▶▶組合せパターン数は、他に類を見ない!

様々な組み合わせのプローブを合成することができます。弊社で取り扱っている蛍光色素やクエンチャーの数が多数であることから、その組み合わせのパターンは膨大です。

組み合わせの一例として、実績数やご注文数が多いものを以下にご紹介します。

5'-6FAM / 3'-TAMRA, 3'-ATTO540Q, 3'-BHQ-1®
5'-6HEX / 3'-ATTO540Q, 3'-BHQ-1®
5'-Yakima Yellow / 3'-BHQ-1®
5'-Cy3 / 3'-BHQ-1®
5'-ROX / 3'-BHQ-2®
5'-TexasRed / 3'-BHQ-2®
5'-Cy5 / 3'-BHQ-3®
5'-Quasar®705 / 3'-BHQ-3®      … etc.

組み合わせパターン、記載のない修飾に関するご相談を随時承っております。
お気軽にお問い合わせください。

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

生物学分野において、ゲノム配列を解読することは非常に重要です。しかし従来は、コストやスピード、処理能力において制限があり、思うように理解を深めるには限界がありました。次世代シーケンスはこれらの問題点を解決することができる、画期的な技術です。解析にかかる処理能力が比べものにならないほど大きく向上し、さらにはゲノム配列だけでは解釈しきれない様々な相互作用に対する考え方に大きな革命をもたらしました。今回は、そんな次世代シーケンスに焦点を当て、クリックケミストリー技術を用いることによって簡便にcDNAライブラリーを構築した例をご紹介したいと思います。

▶▶サンプルのフラグメト作成および酵素的ライゲーションという煩雑なステップを簡便化した「クリックシーケンス」と呼ばれる方法を紹介した文献です。酵素反応のかわりに、銅イオンを触媒としたアルキン・アジドによるクリックケミストリー付加環化反応を用い、一本鎖DNAを生成しています。この一本鎖DNAはトリアゾール環を含みますが、PCR増幅に対して適合性があったと述べられており、次世代シーケンスcDNAライブラリーを構築することが可能であったと報告しています。

ClickSeq: Fragmentation-Free Next-Generation Sequencing via Click Ligation of Adaptors to Stochastically Terminated 3′-Azido cDNAs, Journal of Molecular Biology (2015) 427, 2610–2616

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA

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付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

前回は、アルキン修飾されたDNA二本鎖に、アジド修飾された金ナノ粒子をHuisgen付加環化反応させて、金をきれいに配置する例をご紹介しました。今回は金ではなく、CdSe–ZnSe量子ドットをオリゴDNAとHuisgen反応させる例をご紹介したいと思います。

▶▶コア/シェル型CdSe–ZnSe量子ドットの表面をアジド化し、シクロオクチンで修飾したDNAとHuisgen反応させ、CdSe–ZnSe量子ドット−DNA複合体を合成します。量子ドットをCdSe–ZnSeコア/シェル型とすることで、半導体の発光効率アップを図っています。本文献では、クリックケミストリーによって高効率に、コンパクトで結びつきの強い、水溶性のバイオセンサーが構築されると報告しています。

このQD–DNA複合体donorと蛍光プローブacceptorによるFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)で、SNP(一塩基多型)の解析が可能であったと述べられています。

Robust and specific ratiometric biosensing using a copper-free clicked quantum dot–DNA aptamer sensor, Nanoscale. 2013 Nov 7; 5(21): 10307–10315.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA

/category1/modify/page_85

ご紹介した文献中で登場している蛍光色素をはじめとする「ATTO series」を修飾したオリゴDNAの合成の実績もございます。ご相談ください。

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

様々な分子同士を結合することができるクリックケミストリー。今回は、DNAを用いたナノスケール電子デバイスに焦点をあてます。DNAの連続金属化、DNA回路素子製作に関する様々なアプローチが報告されています。小型化やコスト削減を図るため、またその安定性などから、DNAを用いた電子デバイスが有望視されています。

▶▶ Huisgen反応を利用した電子デバイス開発の例として、電気的スイッチングや電荷蓄積が可能な金属ナノ粒子を、DNA鎖に固定する技術に関する文献をご紹介します。アルキン修飾されたDNA二本鎖に、アジド修飾されたグルタチオン誘導体で官能化された金ナノ粒子をHuisgen付加環化反応させます。すると、金が一分子ずつ密にきれいに配置されます。DNA配列中のアルキン配置によって、金ナノ粒子同士の距離をコントロールすることが可能となることが述べられています。

Chain-like assembly of gold nanoparticles on artificial DNA templates via ‘click chemistry’, Chem. Commun., 2008, 169–171

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA
▶エチニルdSpacer

 

エチニルdSpacerオリゴDNAを紹介します!
エチニルdSpacer修飾オリゴDNA

▶エチニルdSpacer修飾とは?

dSpacerの名前の通り、塩基部を欠いたデオキシリボース環のみの構造です。(前回のe-mailによるご案内で、dSpacer修飾オリゴDNAをご紹介いたしました。ご参照ください。)通常のオリゴDNA鎖において塩基が結合している糖の1´位にアルキン構造が結合しているため、この部分をクリックケミストリー付加環化反応させることができます。このときの反応効率は、高効率が維持されます。Huisgen反応後には、付加環化反応により作られる1,2,3-トリアゾール環が、糖の1´位に位置する構造となります。塩基部を欠いているので、挿入された配列部分の二本鎖の安定性を和らげることができます。DNA配列に導入した際の安定性やその効果はdSpacerと同様です。組み込まれる構造により、二本鎖の安定性をコントロールすることができるとも言われています。

NEW!
日本遺伝子研究所では、エチニルdSpacer修飾オリゴDNAの合成を承ります。オリゴDNA鎖の任意の位置に導入できます。5´や3´末端、インターナル修飾が可能です。

▶1-エチニルdSpacer修飾の応用例として、論文をご紹介します。1,2,3-トリアゾール環が糖の1´位に位置することから、疑似核酸塩基(ユニバーサル塩基)として利用することができると述べられています。本論文は疑似核酸塩基として応用できる一例です。

Click fleximers: a modular approach to purine base-expanded ribonucleoside analogues, Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 6521-6525.

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

いろいろな分子同士を結合することができるクリックケミストリー。今回は、クリックケミストリーを利用したバイオコンジュゲートに焦点をあてます。特にコンジュゲート調製による薬物輸送の効率化に触れていきたいと思います。

siRNA治療薬のデリバリー効果を上げるために、様々な方法が報告されています。細胞親和性をアップさせるための脂質ナノ粒子。葉酸受容体が過剰発現する癌細胞へ伝送されやすくするための葉酸。細胞への取り込み向上のためのPEG。運搬体としてのカチオン性リポソーム…。siRNA治療薬を分解させることなく効率的に輸送するために様々な工夫がなされており、その報告数は数知れず。今回はその中でもクリックケミストリーを利用した薬物輸送の例をご紹介します。

▶▶siRNA を効率的に標的組織へ送達させるための手段として、「葉酸-PEG-siRNAのコンジュゲート」を紹介した文献です。クリックケミストリーを用いて葉酸-PEG-siRNAのコンジュゲートを構築することで効率的にもたらされる、受容体特異的遺伝子のサイレンシング。siRNA治療薬を静脈投与した場合に顕在する課題、すなわち急速な腎クリアランスによる体外排出やヌクレアーゼによる分解、標的細胞へ取り込まれにくい等を解決する方法の一つであると報告しています。

Defined Folate-PEG-siRNA Conjugates for Receptor-specific Gene Silencing, Molecular Therapy Nucleic Acids (2012) 1, e7

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA、RNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

今回は「Bioorthogonal Reactions(生体直行型反応)」について触れたいと思います。

前回、「銅イオンフリー」のクリックケミストリーを題材としました。銅(I)イオン触媒下で加速して進行するクリックケミストリーHuisgen反応ですが、アルキンの替わりにシクロオクチン(DBCO)修飾を利用したり、THPTAを添加することで、銅(I)イオン毒性の懸念を解消できることをご紹介しました。

それではなぜ、銅イオンフリーHuisgen反応が注目されるのでしょうか。
それは、Huisgen反応が生体直行型反応だからです。「Bioorthogonal Reactions(生体直行型反応)」とは、お互いとの間にだけ起こる、生物学的な系では唯一の反応であるということを表しています。例えばNHS-esterは、DNAまたはタンパク質に見られるアミノ基を標識する可能性が、また、チオール基はタンパク質中のスルフヒドリル基と反応する可能性があります。ところが、クリックケミストリーHuisgen反応では、アルキンもアジドも生物学的な系において通常見られない官能基で、生体内での交差反応が起こりません。加えて、アルキンやアジド自体が細胞に与える毒性はないと言われていることから、生体内における特異的な反応には、銅イオンフリーHuisgen反応は非常に有用であると考えられているのです。

▶▶今回も「Bioorthogonal Reactions(生体直行型反応)」に関するレビューをご紹介します。本レビューでは、生体における選択的な反応が困難でありながらも求められる理由とその魅力について、生体直行型反応の重要性と関連させながら述べられています。また、レビューの後半には、生体におけるシクロオクチンを用いた銅イオンフリー反応の応用例が記載されています。バクテリオファージの蛍光ラベル、タンパク質へのアジド導入と蛍光ラベル、タンパク質-タンパク質相互作用の研究、細胞の画像解析など、幅広く紹介されていますので、参考になるアプリケーション例が見つかれば幸いです。

Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology, Chem Soc Rev. 2010 Apr; 39(4): 1272–1279.

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA
NEW!
▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

今回は「銅イオンフリー」のクリックケミストリーをご紹介します。
クリックケミストリーHuisgen反応は、銅(I)イオン触媒下で加速して進行します。しかし、銅(I)イオンは細胞にダメージを与えるため、生体内反応においては、銅イオンフリーであることが必須です。クリックケミストリーHuisgen反応で、銅(I)イオン毒性の懸念を解消するための2つの方法をご紹介します。

1.アルキン修飾の替わりに、シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾を施す
シクロオクチンとは歪みを持ったアルキンです。銅(I)イオンフリーでアジドと反応します。細胞にダメージを与える銅(I)イオンを触媒としないので、細胞内のクリック反応にも応用できると言われています。

2. THPTAを添加する
銅(I)イオンの生物学的毒性を遮断することができます。THPTAは銅(I)イオンに結合し、クリックケミストリーHuisgen反応における触媒の有効性を維持しながら、銅(I)イオンの潜在的な毒性作用を遮断することが報告されています。

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA                                                                                         
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▶シクロオクチン(DBCO:dibenzocyclooctyl)修飾オリゴDNA               
(銅(I)イオンフリーでアジドと反応)

▶▶ここで、銅(I)イオンフリー反応に関するレビューをご紹介いたします。生細胞中または生体内で反応が行われる場合に求められる事項と、多様な反応について述べられています。

Copper-Free Postsynthetic Labeling of Nucleic Acids by Means of Bioorthogonal Reactions, ChemBioChem 2015, 16, 1541 – 1553

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

操作が簡便、反応が特異的で高効率、反応条件が温和…などの利点から、非常に優れた手法であると注目を集めているクリックケミストリー。その特長の一つとして「汎用性の高さ」も挙げられています。

▶▶その利点を生かした例として、オリゴヌクレオチドを用いたクリックケミストリーについて、概説されたレビューをご紹介いたします。例えば、クリックライゲーションで連結したオリゴヌクレオチドを鋳型としてPCR増幅ができること、カテナンをはじめとする環状構造体や、三本鎖・四本鎖についてなど、広く紹介されています。

Click chemistry with DNA, Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 1388–1405

▶▶クリックケミストリーを用いたポリマー合成、生体高分子の機能化など、マテリアルサイエンス分野における応用例が述べられている論文をご紹介いたします。オリゴヌクレオチドをはじめとする生体高分子をターゲットとしたクリックケミストリーにも少し触れられています。クリックケミストリーの可能性を提示した内容となっていますので、ご参考ください。

Click Chemistry in Materials Science, Adv. Funct. Mater. 2014, 24, 2572–2590

日本遺伝子研究所では、クリックケミストリーHuisgen反応用の修飾オリゴDNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA

 

付加環化反応で機能性分子を創りだす
「クリックケミストリー」

Huisgen反応は、クリックケミストリーの中で最も一般的な反応と言われており、分子の片方をアルキン、もう片方をアジドで修飾して結合反応させます。
日本遺伝子研究所では、クリックケミストリー用の修飾オリゴDNA合成を承っております。

▶アジド(-N3)修飾オリゴDNA
▶アルキン(-CΞCH)修飾オリゴDNA

クリックケミストリーは、以下の利点から、非常に優れた手法であると注目を集めています。

・操作が簡便である
・特異的に反応する
・pHに依存しない
・反応溶媒を問わない(水でも可)
・反応効率が良い
・汎用性が高い
…など。

クリックケミストリーは、その反応機構を用いて、様々な応用が期待できると言われています。
次回、オリゴヌクレオチドを用いたクリックケミストリーについて、概説されたレビューをご紹介いたします。

 

qPCR法の新たな技術がここに誕生!
「Hypercoolテクノロジー™」

Hypercool テクノロジー™は、Tm値上昇ヌクレオチドによってTm値を調節し、PCRの増幅サイズを短くデザインすることで、分解されたRNAでもとらえることができる技術です。

▶▶Tm値算出式がミソなんです

Tm値上昇ヌクレオチドによってTm値を調節し、増幅サイズを短くデザインする、Hypercool テクノロジー™。重要なのが、任意のアデニンAやシトシンCをTm値上昇ヌクレオチドに置換したときの実際のTm値です。これまでは置換後のTm値の簡便な算出法がなかったため、そのデザインは容易ではありませんでした。

私たちは、Tm値上昇ヌクレオチドを導入したときのTm値の簡便な算出法を確立。短い増幅サイズのプライマー・プローブのデザイン・合成を可能とし、Hypercoolテクノロジー™による定量PCRを実現しました。

自らデザインしたい方のために、
弊社ホームページにてTm値算出シートを公開しています。

Tm値上昇ヌクレオチドを挿入した配列のデザインにはコツがあります。

qPCR法の新たな技術がここに誕生!
「Hypercoolテクノロジー™」

Hypercool テクノロジー™は、Tm値上昇ヌクレオチドによってTm値を調節し、PCRの増幅サイズを短くデザインすることで、分解されたRNAでもとらえることができる技術です。

▶▶新進気鋭のTm値上昇ヌクレオチド
増幅サイズを短くするには、プライマー・プローブも短くデザインしなければなりません。しかし、プライマー・プローブが短くなると、そのTm値は低下し、PCR条件から外れてしまいます。
Hypercool テクノロジー™では、短くなったプライマー・プローブの塩基配列中のいくつかの塩基を、Tm値上昇ヌクレオチドに置き換えることによって、Tm値を調節し、目的とする温度まで上昇させることができるようになります。配列中のアデニンAを「2-amino-dA」に置換、もしくはシトシンCを「5-Methy-dC」に置換すると、Tm値を1塩基あたり1~2℃上昇させることができます。Tm値(melting temperature:融解温度)とは、二本鎖DNAの半分(50%)が一本鎖になる温度です。

2-amino-dA(2aA): 置換前のチミンTとの結合は2本ですが、置換後の結合が3本となることで、Tm値が上昇します。 

5-Methyl-dC(5mC): 置換前と置換後で結合の数に変化はありませんが、置換後の修飾基の疎水性
(水と混ざりにくい性質)によって結合形成部分の水分子が排除され、結合の力が増強されます。この結合の増強によってTm値を上昇させることができます。


Tm値上昇ヌクレオチドに置換した時、実際にTm値はどのようにして算出するのか?
その算出方法が、本技術の重要なカギとなります。

 

qPCR法の新たな技術がここに誕生!
「Hypercoolテクノロジー™」

▶Hypercoolテクノロジー™なら、できなかったことができる!

FFPE標本からの遺伝子解析について考えたことはありませんか?
できないとあきらめていませんか?
それがかなうことにより、過去の膨大な疾患データを活かした遡及的な研究が可能となります。
Hypercoolテクノロジー™を用いれば、それが実現できます。
Hypercoolテクノロジー™は、疾患の治療や予防に大きく貢献できるものと考えています。

Hypercool テクノロジー™とは、PCRの増幅サイズを短くデザインする技術です。

▶FFPE標本からのリアルタイム定量PCRの限界を打破する!

長期保存したFFPE組織中のRNAの多くは、100bp以下に分解が進行しています。
そのため、リアルタイムPCRで通常設定されるアンプリコンサイズでは、感度や精度が低下し、
その定量的な解析や評価は難しいとされてきました。

分解されたRNAをqPCRできるのか?
・・・できます。Hypercoolテクノロジー™なら。

Hypercool テクノロジー™は、PCRの増幅サイズを50~70bpとすることで、分解されたRNAでもとらえることができる技術です。

その秘密は、Tm値上昇ヌクレオチドにあります。

 

 

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